治疗性肿瘤疫苗的研究进展

余化平 徐燕梅 罗远 林刘娟 李菲菲 宿向东

治疗性肿瘤疫苗的研究进展

余化平 徐燕梅 罗远 林刘娟 李菲菲 宿向东

恶性肿瘤的治疗以手术、化疗、放疗和靶向治疗为主，具有较高的治疗毒性，并存在较大的复发风险，治疗性肿瘤疫苗作为辅助治疗手段，发挥着越来越重要的作用，取得了可喜的成绩，但远没有达到理想的目标。本文综述了当前各种肿瘤疫苗的研制策略及存在的问题，展望肿瘤疫苗的前景和未来。

治疗性；癌症疫苗；肿瘤生物治疗

随着社会的发展、环境及人们生活方式的改变，恶性肿瘤的发病率和死亡率迅速增加，2015年美国癌症协会(ACS)公布的统计数据显示，癌症已成为人类的第一位死因，并有进一步增高的趋势[1]。人们对此已经投入了大量的财力物力，至今仍未攻破这一难关，化疗和放疗仍是晚期癌症的主要手段，其针对肿瘤细胞增殖快的特点进行盲目杀灭，非但无法保证去除所有的肿瘤细胞，还对患者身心健康造成极大伤害。近年来，针对肿瘤生长的驱动基因，如表皮细胞生长因子(EGFR)的分子靶向治疗[2]和针对肿瘤免疫逃逸信号，如程序性细胞死亡分子及其配体(PD-1，PD-L1)的抗肿瘤免疫治疗[3]取得了突破性进展，大大提高了患者生存时间和生活质量。然而，这些肿瘤治疗的毒性反应仍较大，肿瘤细胞获得性耐药仍无法避免，治疗后的复发风险仍较高[4]，仍需探索新的治疗策略。

随着生物化学及免疫学技术的发展，肿瘤抗原概念的提出及证实，治疗性肿瘤疫苗逐渐成为肿瘤治疗的热点。治疗性肿瘤疫苗旨在增强肿瘤细胞免疫原性，激发机体固有的免疫功能和抗癌能力，使机体由被动抗癌向主动抗癌转变，从而使肿瘤缩小，延长患者生存时间，增强放化疗效果。本文综述了近年来的相关研究进展，剖析治疗性肿瘤疫苗的研制策略及存在的问题，推论肿瘤疫苗的前景及其发展的方向。

1 肿瘤的免疫逃逸和免疫识别

肿瘤是一种多基因病，机体细胞在理化学因素和生物因素的作用下发生基因突变，一系列癌基因的激活和抑癌基因的失活，使正常细胞失去分化和成熟的能力，转化为具有无限增殖特性的恶性细胞，如果这些细胞不能被免疫活性细胞识别，逃脱了机体的免疫监视，即可导致肿瘤的发生。由于正常机体内近3万个基因随时都可能发生突变，因此，肿瘤细胞的免疫逃逸和免疫识别是肿瘤治疗中的主要矛盾，如何促使免疫逃逸向免疫识别的转化，是今后肿瘤研究的主要课题。

近年来，由于对肿瘤免疫排斥抗原的认识以及抗原递呈和T细胞识别机制研究的突破性进展，为免疫治疗肿瘤奠定了基础。肿瘤细胞是发生了基因突变的异常细胞，具有与正常组织细胞不同的肿瘤抗原，目前，越来越多肿瘤抗原得到确定，如癌基因产物HER-2/neu，只在癌细胞和睾丸中表达的非突变蛋白(MAGE、BAGE家族)等，部分抗原具有较高免疫原性，能诱导机体产生相应的抗体和细胞毒性T细胞(CTL)反应，诱导机体对肿瘤产生排斥反应。

抗肿瘤免疫主要由CD8+CTL所介导，CTL的充分活化至少需要两个信号[5]：第一信号由抗原递呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合物(MHC)、抗原肽及T细胞受体“三联体”所提供；第二信号为共刺激分子(如B7分子)提供的共刺激信号。肿瘤细胞通过抗原调变减少肿瘤抗原的表达以及减少细胞表面MHC和共刺激分子的表达等机制来逃避机体的免疫识别，同时产生抑制性细胞因子，抑制机体免疫系统功能及诱导免疫细胞调亡。

因此，肿瘤疫苗的研制策略，应该始终把握如何提高肿瘤细胞的免疫原性以及如何增强机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别能力这两个关键问题，来促进肿瘤免疫逃逸向免疫识别转化[6]。目前，增强肿瘤细胞免疫原性的方法大体可分为两类：一是通过基因转染修饰肿瘤细胞；二是利用抗原递呈细胞递呈肿瘤抗原。增强机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别能力的方法，主要是利用各种手段打破自身免疫耐受，增强机体免疫应答能力。

2 治疗性肿瘤疫苗的研制策略

2.1 基于肿瘤细胞的肿瘤疫苗肿瘤细胞具有无限增殖能力，浸润破坏周围正常组织并发生远处转移，危害身体健康，但任何事物均有两面性，肿瘤细胞也可“变害为利”。采用肿瘤自身细胞作为疫苗基础，利用分子克隆技术，将MHC、B7及细胞因子等基因序列靶向导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞丧失恶性表型，同时在细胞表面大量表达MHC及B7等免疫分子，使肿瘤细胞免疫原性大大增强，回输体内即可通过“旁细胞效应”杀伤机体肿瘤细胞，动物试验及临床应用均取得了成功，尤以白介素-2(IL-2)和粒-单集落刺激因子(GM-CSF)单独或联合应用效果突出[7-8]。一项研究[9]评估了GM-CSF为佐剂的HER2/neu疫苗治疗乳腺癌切除术后患者的预后情况，结果显示，术后20个月疫苗治疗组较对照组复发率显著降低，且毒性作用较低。

双特异抗体(Bi-mAb)能与两种抗原结合，用其修饰肿瘤细胞，也可提高肿瘤细胞免疫原性。Bi-mAb一端与肿瘤细胞上的抗原结合，另一端与T细胞表面的免疫分子结合，因其所结合的抗原是特异性的，不会再与体内的其他自身抗原结合。这样，肿瘤细胞便被“拉近”T细胞，不但可以直接提供共刺激信号，而且使两种细胞的其他分子更易靠近结合，发挥增强的共刺激作用[10]。

基于肿瘤细胞的肿瘤疫苗存在潜在的问题：某些肿瘤细胞的体外长期培养有一定困难；肿瘤细胞携带的癌基因及肿瘤病毒是否有致癌的危险；可能产生对自身肿瘤抗原的免疫耐受。

2.2 肿瘤抗原肽疫苗利用肿瘤抗原表位肽序列人工合成的多肽疫苗，能模拟T细胞识别的肿瘤抗原决定簇，不经APC递呈过程，即可直接与MHC分子结合，激活T淋巴细胞，诱导强有力的特异性抗肿瘤细胞免疫，是目前主动免疫治疗恶性肿瘤的一项新策略。

肿瘤治疗性多肽疫苗发展的前提是肿瘤抗原的发现及其CTL表位的鉴定。自1989年BOON等首次发现肿瘤特异性抗原以来，已有几十种肿瘤抗原被发现，并已有许多CTL表位被鉴定。采用肿瘤抗原肽进行肿瘤免疫治疗，目前的水平是，凡已克隆的肿瘤抗原基因，便可从其核苷酸序列推断其编码蛋白，从蛋白的氨幕酸序列中找到能与特定的MHCⅠ类分子相结合的肽片段，然后进行表位设计，对肿瘤抗原的核心肽段加以改造，以得到高亲和力的具有免疫原性的肽段疫苗，再应用人工合成的肿瘤T细胞表位免疫防治肿瘤，因而为肿瘤免疫带来新的希望[11]。目前，多肽合成疫苗研究较多的有：黑色素瘤肿瘤抗原MAGE家族，人乳头状瘤病毒HPV16 E7的合成肽，癌基因、抑癌基因产物的肽片段以及粘蛋白Mucin等。MAGE-A3抗原疫苗与免疫刺激剂结合，在晚期转移性黑色素瘤中有活性[12]，然而，新近公布的MAGRIT研究，其为非小细胞肺癌(NSCLC)术后辅助治疗的多中心随机双盲对照Ⅱ期研究，结果显示辅助MAGE-A3疫苗较安慰剂在所有人群和未接受化疗人群中均不改善无病生存率(DFS)，任何亚组都未观察到获益[13]。但另一项包含血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和2(VEGFR2)多肽的多价疫苗，在治疗晚期或复发性NSCLC患者的研究结果却令人鼓舞，共15位受试者接受疫苗治疗，7例患者至少在2个月内疾病稳定，受试者的平均存活时间为398 d，1年和2年生存率分别为58.3%、32.8%[14]。

此类疫苗的特点是安全、特异性高。存在的问题是只能用于相同人类白细胞抗原(HLA)位点的患者，人工合成的抗原多肽，是一种直链结构，缺乏天然蛋白的三维构型；蛋白疫苗在体内将迅速降解，维持时间较短；合成肽分子小，免疫原性差。

随着表面展示技术的发展，将肿瘤抗原多肽展示在噬菌体[15]或真核细胞[16](如酵母细胞)表面，可制备多价抗原肽疫苗，充分模拟体内抗原表位的折叠及空间构型，针对不同的肿瘤类型或多个肿瘤抗原进行免疫，扩大了疫苗的抗瘤谱，成为一种新的思路。

2.3 抗独特型抗体疫苗根据免疫网络学说，抗独特型抗体Ab2可视为抗原的内影像，可模拟抗原决定簇的结构，制备成为肿瘤特异性主动免疫疫苗，取代抗原诱发抗肿瘤免疫反应[17]。

抗独特型抗体制备简单，免疫原性强，不需先分离鉴别肿瘤相关抗原，只需以所需抗原的单抗为免疫原制备抗体，尤其适合于难以获得抗原成分的肿瘤抗原，此项研究已经引起广泛的关注。

近年来以基因工程方法制备人源化抗体如嵌合抗体，CDR移植抗体，构建单链Fv片段等，解决了单抗用于肿瘤治疗所存在的某些问题。但目前抗独特型肿瘤疫苗以鼠源性为主，需要进行人源化改造，同时模拟多个抗原决定簇以及扩大其抗瘤谱的工作仍很艰巨。

2.4 DNA疫苗DNA疫苗是指直接把带有目的抗原基因的重组质粒转染或注射到动物细胞中，使之在细胞内持续表达出天然的抗原物质，这些目的蛋白质经正确的糖基化修饰等加工处理后，与MHC抗原形成复合物并被递呈到细胞表面，诱导特异性CTL及体液免疫应答[18]。

肿瘤DNA疫苗是在其他几种肿瘤疫苗与核酸技术基础上发展起来的，找到明确的肿瘤抗原并确定编码该抗原的DNA序列是疫苗研制的关键，许多肿瘤DNA疫苗所用的基因就是重组亚单位蛋白疫苗的编码序列，但DNA疫苗更具灵活性，因为它可以组合多种基因以及共刺激分子做疫苗，这样可以提高免疫效果，从而使DNA疫苗成为肿瘤防治的一条重要途径。目前已成功研制出用于乳腺癌、卵巢癌等的DNA疫苗。一项最新研究中，14例乳腺癌患者接受了乳腺珠蛋白-A(MAM-A)DNA疫苗治疗，初步研究显示，MAM-A DNA疫苗可诱导CD8+T细胞反应，延长转移性乳腺癌患者PFS[19]。

DNA疫苗的问题是：①长期表达低水平的外源抗原，有引起免疫耐受性的可能。②质粒DNA免疫有可能诱导产生针对质粒自身的抗体，从而降低免疫效果。③基因整合问题是基因疫苗安全使用所存在的最大问题。

2.5 基于APC的肿瘤疫苗抗原递呈细胞(APC)将肿瘤抗原处理成特定肽段，定向递呈给免疫细胞，因此在肿瘤的免疫应答中发挥着重要的作用。利用APC递呈肿瘤抗原，主要有两种手段，一是用APC负载肿瘤抗原信号，如肿瘤抗原多肽或肿瘤基因片段，使APC具有特异性抗肿瘤作用；二是利用融合细胞技术，将APC与肿瘤细胞融合，使融合细胞具有双亲细胞的特性，既表达肿瘤抗原，具有肿瘤源性，又表达大量的免疫相关分子及共刺激信号，具有强大的抗原递呈功能。细胞融合后，肿瘤细胞丧失了致瘤性，通过加工处理肿瘤抗原而增强免疫细胞识别肿瘤细胞的能力，并分泌大量的细胞因子，激活其他免疫分子，诱导非特异性肿瘤免疫[20]。

B细胞和树突状细胞(DC)是最常采用的抗原递呈细胞，进行细胞因子基因修饰后，可进一步增强其抗原递呈作用[21-22]。其中，DC表达大量的MHC和B7分子，是目前已知的抗原递呈能力最强的APC，通过摄取、加工、提呈抗原，从而刺激初始型T细胞增殖与活化，使细胞免疫激活，尤其是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的反应，在机体抗肿瘤中发挥着非常重要的作用[23-24]。DC疫苗无论在动物试验还是在临床应用中均显示出良好前景，通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，再回输给患者，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应[25]，2010年，美国FDA批准第一个DC疫苗“Provenge”用于晚期前列腺癌的治疗[26-27]。由于“Provenge”的Ⅲ期临床试验不仅延长了患者的生存期，还没发现显著的副反应，DC疫苗便成为肿瘤研究领域的热点[28]。DC疫苗可以引起肿瘤特异性免疫反应，延长无进展生存期，无明显毒副反应，在多种肿瘤中，如胶质瘤、结直肠癌、黑色素瘤肝癌等都证实了这个结果[29-31]。日前，美国杜克大学医学中心的一项研究更是鼓舞人心[32]。他们在给脑胶质瘤患者进行DC疫苗注射前进行破伤风/白喉毒素(Td)预处理，发现进行Td预处理可以促进DC细胞迁移，显著延长中位总生存期(OS)，3例患者已达到36.6 m，而未行Td预处理患者mOS仅为18.5 m。

DC疫苗有很强的抗瘤活性，但需要大量激活DC细胞，疫苗制备工艺复杂，比较费时、费力。

2.6 CAR-T疫苗随着对T细胞受体(TCR)信号的深入了解，T细胞与嵌合抗原受体(CAR)治疗晚期难治性B细胞恶性肿瘤已经非常成功[33]。多项研究显示，CAR-T技术在实体瘤中也展现出优异的疗效[34-36]。第55届美国血液学年会(ASH)上，发布了关于CAR-T疫苗的治疗应用，当被导入T细胞或其他免疫细胞时，CARs会引发靶向肿瘤T细胞的迅速繁殖，比任何一种已知的免疫反应都要迅速。然而，CAR-T疫苗仍存在许多挑战，例如抗原的低特异性导致脱靶效应、T细胞中插入外源DNA片段时存在插入突变的风险，改善这种疗法的安全性和有效性目前显得尤为重要。

3 肿瘤疫苗研究的前景

肿瘤疫苗的研制依然任重而道远。当前，肿瘤疫苗的研究远非尽善尽美，对于肿瘤负荷较大的肿瘤患者，单纯依靠疫苗的使用来治愈肿瘤的可能性很小，只能作为传统治疗的辅助治疗手段，用以降低肿瘤的复发率、抑制肿瘤的转移来延长患者的生命，提高生活质量。随着人类基因组计划的逐步完成，国内外学者提出了“一个基因一个药物”的蓝图，提倡肿瘤治疗的个体化，但在肿瘤疫苗研究中，除了要求特异性和高效性以外，普遍适用原则是追求的重要目标。由于免疫识别及免疫杀伤过程中MHC限制性，决定了肿瘤疫苗使用的受限，如果能发现一些所有肿瘤患者共有的标记物，不受HLA特异性的限制，制备成针对全部肿瘤细胞的“万能疫苗”，将是未来肿瘤疫苗的发展方向。

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Treatments of malignant tumor mainly have surgery，chemotherapy，radiotherapy，and targeted therapy，which bears high toxicity and great recurrent risks.Therapeutic tumor vaccine，as an adjuvant therapy，is playing a more and more important role with favorable performance，but it is still far from the ideal target.The paper summarizes the development strategy of present tumor vaccines and the existing problems，and introduces the prospect and future of tumor vaccines.

Therapeutic；Tumor vaccine；Tumor biotherapy

2015-08-12)

1005-619X(2015)10-1038-05

10.13517/j.cnki.ccm.2015.10.011

614205成都军区峨眉疗养院(余化平)；614000乐山市人民医院(徐燕梅，罗远林，刘娟，李菲菲，宿向东)