大鼠肝纤维化实验动物模型的建立方法*

那 坤，武 亮，李 滢，郑 莹，谢晶日

(1．北京小汤山医院，北京 102211;2．黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040)

大鼠肝纤维化实验动物模型的建立方法*

那 坤1，武 亮1，李 滢1，郑 莹1，谢晶日2

(1．北京小汤山医院，北京 102211;2．黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040)

以往文献报道肝纤维化动物模型的造模方法造模周期长、动物死亡率高、造模成功率低，在参考以往造模方法的基础上，对原有造模方法加以改进并得到很好的造模效果，希望能为以后肝纤维化动物模型的制备提供新的思路和方法。

肝纤维化;动物模型;方法探析

1 中医药学对肝纤维化的理解和认识

从中医药的古典和书籍中找不到对肝纤维化的记录和描述，肝纤维化是现代医学的病理形态学概念，在临床中以胁下积块、胁部胀痛、黄疸等为主要临床表现。在中医文献中“瘕积”、“胁痛”、“瘀血”、“积聚”、“臌胀”等病证的临床表现与肝纤维化的临床表现相符合。同时因病变积聚于肝，病情反复缠绵难愈，故被医家称之为“肝著”、“肝积”之病。

中医药学认为，本病病因复杂，病机变化较多。多数学者认为［1］湿热疫毒是本病最为常见的病因，湿、热、毒、瘀、虚为本病的病理因素。本病发病的关键在于机体正气的弱与强，根据正气的强弱程度不同，会有各种不同的临床表现，对本病的预后和转归都有不同的影响。正气存内，祛邪外出，可以很快恢复且无后顾之忧。但多数病人由于疫毒侵袭、致病力强、正气不充或禀赋不足、邪正交争，进而导致邪胜正衰，肝脾肾诸脏俱受累。湿热之邪，性本黏滞，缠绵难愈，气机易受阻滞;肝失疏泄，脉络受阻，气滞血瘀，血行不畅，而成积聚。气滞、血瘀、湿积、津伤相互夹杂影响，鼓胀的病因病机即在于此;同时由于湿热瘀积、化燥化火、深入心营，进而出现生风、动血的变化，则多为病情危重难以救治。

2 现代医学对肝纤维化发病机理的认识

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(ECM)的增生和降解之间失去动态平衡，从而诱发肝脏内纤维结缔组织开始出现异常沉积，最终导致肝脏结构和功能的变化，轻等程度称为肝纤维化，重等程度使肝小叶结构重建、结节和假小叶形成，称为肝硬化［2-3］，是由肝炎病毒、血吸虫、药物与毒物、代谢和遗传、酒精、胆汁瘀积、自身免疫性肝病等不同损伤因素较长时间慢性刺激肝脏引起炎症所形成的。由于难以根治和危害面广，而与癌症、艾滋病并称“世纪三大顽症”。美国著名肝病学家 Hans Popper曾指出:“谁能阻止或延缓肝纤维化的发生，谁将治愈大多数慢性肝病。”“肝炎→肝纤维化→肝硬化“组成的“三步曲”是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。由于肝硬化是肝脏实质性病变较难逆转，而对于各种肝炎的治愈率不理想且费用昂贵，因此国内外学者不约而同地把目光转向“三步曲”的中间环节——肝纤维化。

最近10多年来，肝纤维化的研究在以下方面取得较大进展［4］:正常肝脏和纤维化肝脏ECM的各种主要类别、成分、分子结构、组织分布及其功能作用;ECM的细胞外降解及其调节，主要是基质蛋白酶及其抑制物的发现;HSC在肝纤维化进程中的核心作用;HSC的活化机制;胶原合成各环节的调节机制;肝纤维化发生时的关键性细胞因子，其细胞来源、作用方式及其信号传导途径;肝纤维化的非创伤性诊断模型;肝窦毛细血管化作为肝纤维化基本特征的新认识;建立完善的肝脏实质细胞和非实质细胞的体外分离培养技术;肝纤维化的中医药以及现代生物医药临床治疗。肝纤维化的发生机制是一个极为复杂的病理过程，涉及到组织病理学、细胞学、细胞因子及其基因水平的调节。简而言之，主要是由各种致病因子导致肝细胞损伤，如转化生长因子β(TGF-β)、转化生长因子α(TGF-α)、库普弗细胞(KC)、血小板衍化生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)等一些细胞因子。与此同时，细胞因子的网络调控失常，进而导致纤维化因子的过度表达，起到抑制作用的细胞因子表达程度低下，从而使胶原降解不足，进而在肝脏内大量沉积，导致肝纤维化的形成。在肝纤维化形成过程中，会涉及到很多种细胞和细胞因子之间的相互作用，其中以TGF-β1和HSC尤为重要，二者在肝纤维化的发生发展和维持阶段中起主要作用，最终导致的结果是ECM合成增加，降解减少。

建立成功的肝纤维化动物模型，是开展肝纤维化基础实验研究必不可少的重要条件之一。目前，建立肝纤维化实验动物模型的方法有很多种［5］，主要有化学性、酒精性、病毒性、免疫性、寄生虫性、营养性、胆汁性、放射性、复合因素性肝纤维化动物模型等。其中化学性肝纤维化实验动物模型较多应用的化学物质是四氯化碳(CCL4)和二甲基亚硝胺(DMN)。用CCL4诱导大鼠肝纤维化模型是一种经典的造模方法，其作用机制主要是通过细胞色素P450将CCL4分解为CCL4自由基团，从而引起肝细胞的脂质过氧化反应，与此同时小叶中央区的肝细胞被选择性的破坏。在肝细胞的内质网中，肝微粒体内通过细胞色素P450混合功能氧化酶的活化之后，CCL4合成具有活性的三氯甲基自由基和氯甲基自由基，二者会与肝细胞内的大分子产生结合，引起脂质过氧化反应和活性氧自由基的产生，促使肝细胞出现损伤，进而引起狄氏间隙内静止的HSC发生活化反应，从而释放出Ⅳ型胶原酶来降解Ⅳ型胶原。与此同时，HSC停止分泌Ⅲ型胶原，而开始合成分泌I型胶原，替代Ⅳ型胶原，从而加速肝纤维化的形成。

3 常用的造模方法

通过CCL4诱导的肝纤维化实验动物模型造模方法简便且成功率高，将CCL4溶于橄榄油、甘油、花生油之中，可经腹腔注射、皮下注射或灌胃等一些方法进行造模。本动物模型的优点在于，在实验早期就能够见到明显的肝细胞损伤情况和炎症反应变化，到实验的第6～9周时就能够见到比较明显的肝脏纤维组织的增生［6］。CCL4诱导的肝纤维化动物模型在形态学和病理生理学的很多方面都与人的肝纤维化病变尤为相似。如两者都存在肝细胞坏死后再次生长的这个过程，在肝硬化晚期纤维浸润是不能够逆转的，实验动物表现出的肝功能异常和体征与人的慢性肝病发展为肝硬化的过程极为相似。因此，CCL4诱导肝纤维化的方法被普遍应用在研究肝纤维化发生机制以及与组织病理的相关性和血清学标志物，或者抗肝纤维化药物的疗效评价中。但该动物模型制造方法也有动物死亡率相对较高的缺点，在停止给予造模药物后，有些动物会有一定自然恢复的趋势。但单一因素造模方法造模周期较长、动物模型成功的比例较低，因此目前很多学者都运用CCL4复合因素制备肝纤维化动物模型。此种造模方法造出的模型质量高，同时动物模型成功的时间较短，肝纤维化进展稳定，比较适用于以造成肝细胞损伤作为初始机制的肝硬化病因病机发展过程的动态研究。韩德五［7］运用复合因素进行造模，给予造模动物低蛋白高脂的饮食，采用玉米面为动物饲料，添加0.5%胆固醇，在实验开始的前2周在饲料中添加20%猪油，同时采用30%的酒精作为造模动物的惟一饮料，给予每周1次的皮下注射40%CCL4溶剂4ml/kg体质量。在实验进行到第6周末即可形成肝硬化模型。此造模方法操作简单方便，肝纤维化动物模型成功率高达95%，死亡率低于20%，病变分期明显，1～2周为肝细胞变性坏死期，3～4周为肝纤维化坏死期，5～6周为肝硬化期。本造模方法具有敏感性高、重现性好、差异性小等优点，在目前肝炎病毒复制肝纤维化模型尚未成熟的前提下，运用CCL4复合因素造模是较理想的造模方法之一。

4 经过改造的造模方法

国外学者TaukamotoH等在对肝纤维化动物模型的研究评价中指出［8］，理想的肝纤维化模型应与人类疾病所致的肝纤维化形态和特征相同，可以根据肝纤维化的类型不同而变动，且其病理学改变是逐渐形成的。鉴于以上要求，课题组参考阅读了很多文献报道，最终选取CCL4复合因素肝纤维化的动物模型制造方法，其方法操作简单方便，诱导出的肝纤维化模型在病理生理学、形态学很多方面与人类肝纤维化发生发展极为相似，如两者都有肝细胞坏死之后的再生过程，动物模型在实验过程中表现出的肝功能和体征异常与人的慢性肝病发生发展为肝硬化过程尤为相似。但在进行预实验时也发现几个问题需要引起我们注意:一是如果完全按照参考文献报道的用30%酒精作为惟一的饮料饮用，造模大鼠状态很差，几乎每天很少饮水，将酒精浓度降低到10%时，造模大鼠才逐渐恢复饮水。二是CCL4橄榄油溶液在注射时需要进行皮下注射或腹腔内注射。我们在实验中运用皮下注射，在进行CCL4橄榄油溶液注射时需将大鼠脊背部位皮肤捏起进针，若感觉到有进针落空感之后才可以进行药物注射，非正确注射可导致局部范围皮肤的破溃坏死甚至导致大鼠马上死亡。三是在建造动物肝纤维化模型早期，需要完全遵照0.35ml/100 g体质量的造模给药剂量进行注射，同时还要密切观察造模大鼠的精神状态、活动状况、行为和皮肤毛色，如果在造模给药的过程中模型大鼠的体质量出现较为明显的下降，同时伴有皮肤毛发干枯发黄、精神萎靡、活动较差，就需要考虑根据情况减少造模药物的剂量，否则便会导致造模大鼠的死亡。经统计以上造模方法的死亡率约25%，总体比较死亡率低于其他动物的肝纤维化造模方法。最后研究结果显示，采用CCL4复合方法进行肝纤维化动物造模制备后，造模大鼠即出现喜睡、精神萎靡、活动量减少、食欲减退、皮毛浅、发黄干枯、缺少光泽等情况，大约到4周时造模大鼠出现毛发明显变黄、色泽黯淡、易激怒、性情急躁、尿液变黄、逐渐消瘦等。有些模型大鼠的脊背部出现包块和溃疡，排便出现稀便、肛周污染等症状。8周后取材时模型组大鼠出现明显的肝纤维化表现，肉眼可见模型组大鼠肝脏明显肿大、边缘变钝、质地变硬、颜色变浅、包膜变厚、表面粗糙触有结节感，可见细颗粒状结节呈黄褐色。个别肝小叶与腹腔其他脏器黏连，切面可见黄色脂肪变。HE染色结果光镜下可见，大鼠肝脏小叶结构紊乱，中央静脉偏离或消失;肝细胞索排列紊乱，汇管区扩大有大量炎症细胞浸润，中央静脉区及肝小叶周边区出现肝细胞大泡性脂肪变性。以上病理改变与肝纤维化的病理改变基本一致，由此可见该模型符合肝纤维化模型标准。

5 小结

动物模型的成功建立是动物实验成功的前提和基础，我们建立各种动物模型的方法大多是参考以往的文献，并严格按照以往文献的造模方法建立动物模型，有时可能不会建成符合我们要求的动物模型，这样我们就需要在以往造模方法的基础上探索和研究并加以改进。以上为笔者在建立肝纤维化大鼠动物模型时的一点摸索和心得，希望能对以后的肝纤维化动物模型的建立方法提供一些新思路和新方法。

［1］ 高峰，程留芳．中医药抗肝纤维化作用机制的研究［J］．现代中西医结合杂志，2005，14(5):395-398．

［2］ Atzori L，Poli G，Perra A．Hepatic stellate cell:a starcell in the liver［J］．Int J Biochem Cell Biol，2009，41(8-9):1639-1642．

［3］ Geng J，Peng W，Huang Y，et al．Ginsenoside-Rg1 fromPanax notoginseng prevents hepatic fibrosis induced bythioacetamide in rats［J］．Eur J Pharmacol，2010，634(1-3):162-169．

［4］ 张莎莎，吕文良，张旭，等．肝纤维化的治疗研究进展［J］．浙江中医药大学学报，2012，36(4):472-474

［5］ 黄迪，古维立，胡志文，等．大鼠肝纤维模型建立及肝纤维化的检测［J］．广州医药，2012，43(5):

［6］ 张磊，李俊，朱鹏里，等．四氯化碳诱导大鼠肝纤维化进展期和恢复期模型的建立［J］．中国药理学通报，2011，27(12): 1757-1760．

［7］ 韩德五，马学惠，赵元昌．肝硬化动物模型的研究［J］．山西医药杂志，1979，8(4):1．

［8］ Benyon RC，Iredaie JP．Is liver fibrosis reversible?［J］．Gut，2005，46(3):443-446．

国家级名老中医孙树椿在北京收徒

本刊讯 2015年3月13日下午，中国中医科学院首席研究员、国家级名老中医孙树椿教授收徒仪式暨首届北京市复合型中医药学术带头人研修班学员贾育松拜师仪式在北京举行。北京市中医管理局局长屠志涛，第二届国医大师、中日友好医院内科首席专家晁恩祥，中国中医科学院望京医院院长朱立国、党委书记程爱华，北京中医药大学东直门医院院长王耀献、副院长高颖，北京中医药大学第三附属医院副院长王庆甫，骨科知名专家孙呈祥、方建国、刘长信等40余人出席会议。中国工程院王永炎院士为拜师仪式发来贺信。

孙树椿教授从医50余载，他早年师从骨伤科名医刘寿山先生，尽得清上驷院绰班处(绰班为满语意为正骨医生)骨伤科医道真传，领悟了“机触于外、巧生于内、手随心转、法从手出”的正骨推拿要旨后博采大江南北诸家名医之长，结合自己的临床经验，形成了“入其法而又出其法”的独特手技，进而发展成独具特色的孙氏筋伤学术和筋伤疾病的特色手法，成为首批国家非物质文化遗产传承人，是骨伤领域的领军人物。贾育松主任医师出生于中医世家，北京中医药大学博士后，东直门医院骨科主任，一直从事中医骨伤临床和科研工作，是中医骨伤科界的后起之秀。这次孙树椿与贾育松结成师徒关系，有益于弘扬中华优秀传统文化，推动中医骨伤科学术传承及创新，加速复合型中医药人才的培养，促进中医药学术文明的发展。

在拜师仪式上，高颖福院长向孙树椿颁发了聘书。贾育松按照传统礼仪递交了拜师贴并献茶、献花。孙树椿回赠了两部骨伤著作，寓意了薪火传承的美好期望。

屠志涛局长在讲话指出，首先，孙树椿教授收徒对促进北京市传统医学的发展，尤其是中医骨伤科学的发展具有重要意义，是发扬优秀中华传统文化、中医药学术的薪火传承及培养复合型中医药人才培养的一个重要举措。其次，孙树椿名医传承工作站做了很多工作，为推动北京地区中医骨伤科发展做出了贡献。第三，期望通过我们的努力，为推动并规范医疗市场的发展做出贡献。相信通过师徒传承这一途径，一定能够把中医药学术发扬光大，为社会各界提供更高水平的医疗服务。

Methods to Establish the Animal Model of Experimental Liver Fibrosis in Rats

NA Kun1，WU Liang1，LI Ying1，ZHENG Ying1，XIE Jing-ri2
(1．Beijing xiaotangshan hospital，Beijing 102211，China; 2．The first hospital affiliated to heilongjiang university of Chinese medicine，Haerbing 150040，China)

In the literature of liver fibrosis animal model building methods，building cycle is long，animals high mortality，on the basis of reference past methods of building，the original building method is improved．We got very good effect on building the animal modeland hope it can provide animal models of liver fibrosis after preparation with new ideas and methods．

Liver fibrosis;Animal models;Methods analysis

R256．42

A

1006-3250(2015)03-0272-03

2014-10-25

黑龙江中医药大学自主选题项目

那 坤(1980-)，男(满族)，黑龙江鹤岗人，主治医师，医学博士，医学博士后，从事中西医结合预防和治疗消化系统疾病的临床与研究。