性传播艾滋病患者抗艾滋病毒治疗后的HIV-1pol区基因突变研究

路新利，赵宏儒，王 伟，赵翠英，白广义，张玉琪，李 岩，王莹莹，陈素良

性传播艾滋病患者抗艾滋病毒治疗后的HIV-1pol区基因突变研究

路新利，赵宏儒，王 伟，赵翠英，白广义，张玉琪，李 岩，王莹莹，陈素良

目的 分析河北省正在参加抗艾滋病毒治疗的通过性接触感染HIV者耐药性。方法 采集辖区内正在接受抗艾滋病毒治疗的性接触感染HIV者的血浆，进行HIV基因型检测，分析基因突变。结果 研究发现231例患者中有68例患者发生了基因突变，对抗艾滋病毒药物产生了不同程度的耐药性,耐药发生率为29.44%(68/231)。逆转录酶抑制剂的耐药发生率(29.00%,67/231)远高于蛋白酶抑制剂的耐药发生率(0.87%,2/231)。结论 抗病毒药物的诱导作用是导致耐药突变的主要原因，在治疗过程中适时进行耐药监测是必要的，可为制定最佳治疗方案提供数据。

艾滋病病毒;性接触;高效抗病毒治疗；耐药突变

河北省自1989年发现首例艾滋病以来，通过性接触感染艾滋病毒(HIV，human immunodeficiency virus)的HIV/AIDS患者呈现逐年上升趋势，近几年来性接触传播在所有传播途径中占据第一位[1]。四免一关怀政策实施以来，经过10年的免费抗艾滋病毒治疗历程，改善了艾滋病患者的健康状况，延长了他们的寿命[2]。但随之而来的问题也开始出现，HIV RNA开始发生适应抗病毒药物的位点突变，这些位点突变不同程度地减低了抗病毒药物的灵敏性，甚至发生失效[3]。本论文研究了231例因性接触而感染HIV的HIV/AIDS患者在接受抗病毒治疗过程中所发生的位点突变情况。

1 资料与方法

1.1 研究对象 231例患者均来自于河北省辖区内，为性接触感染HIV-1者，正在参加抗病毒治疗，病毒载量≥1 000拷贝/mL。采集他们的EDTA抗凝全血10 mL,分离血浆后进行耐药基因型检测，并收集他们的治疗信息和基本资料进行分析。

1.2 方法

1.2.1 病毒载量测定 用美国Roche公司的COBAS AMPLlCOR(TaqMAN 48)全自动核酸测定仪测定病毒载量，最低检测限为20拷贝/mL。

1.2.2 HIV-1 RNA的提取 采用德国QIAGEN公司QIAamp( Viral RNA Mini Kit 提取HIV-1 RNA，严格按照说明书进行操作。

1.2.3 引物 第1组引物为HN1，HN2，HN3，HN4，第2组引物为MAW26，RT21，PRO-1，RT20。引物碱基序列分别为：Outer upper-primer ( HN1)：5′-CCT AGG AAA AAG GGC TGT TGG AAA TGT GG-3′：Outer lower-primer (HN2)：5′-AAC TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-3′; Inner upper-primer ( HN3) ：5′-GAG AGA CAG GCT AAT TTT TTA GGG A-3′; Inner lower -primer(HN4) ：5′-CAT TTA TCA GGA TGG AGT TCA TA-3′，MAW26：5′-TTG GAA ATG TGG AAA GGA AGG AC-3，RT21：5′-CTG TAT TTC TGC TAT TAA GTC TTT TGA TGG G-3′， PRO-1：5′-CAG AGC CAA CAG CCC CAC CA-3′， RT20:5′-CTG CCA GTT CTA GCT CTG CTT C-3′。

选用Promega公司的试剂以及该公司生产的逆转录酶M-MLV，引物为RT21，RNA模板量为10 μL，合成cDNA，具体反应体系及操作程序按照试剂说明书进行。

1.2.4 目的基因片段的扩增[4]首先，使用HN1、HN2进行第一轮扩增HIV-1pol区基因(反应程序：94 ℃ 1 min，60 ℃ 1min，72 ℃ 90 s，3个循环，然后94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环，72 ℃延伸10 min)，以第一轮产物为模板，以HN3、HN4为引物进行第二轮扩增，反应程序同第一轮。使用第二组引物时，利用RT21为特异性引物合成的cDNA为模板，以MAW26为第一轮反应引物进行第一轮扩增,反应程序:94 ℃预变性5 min;然后94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃ 150 s ,30个循环，72 ℃延伸10 min，然后以第一轮产物为模板，以PRO21、RT20为引物，进行第二轮扩增，反应程序:94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。

1.2.5 扩增产物的鉴定及序列测定 利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，并以DNA Marker (DL2000)作为电泳参照物。阳性结果交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。使用Contig Express软件做序列拼接处理原始核苷酸序列，参照测序图谱进行基因序列修订后，直接进入web站http://hivdb.stanford.edu进行耐药性分析。

1.3 统计学分析 应用SPSS 19.0 软件对所得到的研究数据进行统计学描述和卡方检验分析。

2 结 果

2.1 耐药发生率 231例研究对象中有68例患者发生了位点突变，导致了耐药性，耐药发生率为29.44%(68/231)，其中蛋白酶编码区基因位点突变发生率为0.87%(2/231)，逆转录酶编码区突变发生率为29.00%(67/231)。

2.2 耐药位点及耐药图谱 2例蛋白酶编码区发生突变的患者中有1例患者不仅在蛋白酶编码区位点46处发生了M46L，导致蛋白酶抑制剂(PIs，Protease inhibitor)ATV/r、FPV/r、IDV/r、LPV/r潜在低度耐药和NFV低度耐药，而且在逆转录酶编码区184位点出发生了M184V突变，造成逆转录酶抑制剂(RIs，Reverse Transcriptase Inhibitor)3TC和FTC高度耐药，另1例患者只发生了Q58E突变，该突变可使TPV/r和NFV灵敏性降低。

在逆转录酶编码区，针对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs，Nucleoside reverse transcriptase inhibitors)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs，Non nucleoside reverse transcriptase inhibitors)的突变位点较多，例如184、75、41、215、65、181、103、108、179等位点，这些位点突变可导致抗病毒药物灵敏性不同程度地降低或失效。在231例患者中突变频率最高的是M184V(19.91%)。见表1、2。

2.3 耐药影响因素 231例研究对象中男女性别比为1.7∶1。平均年龄为(39.28±19.71)岁；均为性接触传播，包括同性性传播和异性性传播，治疗时间平均为(26.91±15.07)月；CD4细胞绝对数平均为123±11.66，病毒载量的lg平均值为3.98±0.85。治疗方案主要以一线方案为主。卡方检验结果显示在表1的各项因素中，基因亚型、治疗时间、CD4细胞数和病毒载量是HIV-1 RNA发生耐药性突变的无统计学意义影响因素(P<0.05)。而患者的性别、性行为和治疗方案的选择对耐药突变的影响无统计学意义(P>0.05)。

Note: S--Susceptible; P--Potential low-level resistance; L--Low-level resistance; H--High-level resistance; M--Intermediate resistance.

Note: S--Susceptible; P--Potential low-level resistance; L--Low-level resistance; H--High-level resistance; M--Intermediate resistance.

3 讨 论

有研究显示本研究对患者的性别、HIV-1亚型、CD4数、治疗时间、病毒载量等基本信息和临床资料进行了卡方检验统计学分析，结果显示CRF01_AE与B亚型、治疗时间的长短可显著影响HIV-1 RNA位点突变(P<0.05)，同时作为评估抗病毒疗效的重要实验室参数，CD4细胞数的高低和病毒载量的多少都具有统计学差异(P<0.05)，治疗时间越长，CD4细胞数越低，病毒载量越高，耐药发生率越高。提示长期使用某一种药物或某一种治疗方案易诱发基因突变，增强患者对药物的耐受性[5]。

本次研究发现与PIs相关的位点突变包括次要突变Q58E(1例)和主要突变M46IM(1例)，这两个位点突变导致NFV、LPV/r等部分蛋白酶抑制剂低度耐药。产生Q58E的患者没有使用蛋白酶抑制剂，可能有交叉耐药产生，而出现M46L突变的患者在治疗方案中加入了克力芝(LPV/r)，推测认为是其诱发了HIV-1 RNA的适应性突变。

在逆转录酶编码区发生突变位点主要处于41-219区段(核苷类逆转录酶编码区)和101-190区段(非核苷类逆转酶编码区)。这些突变导致3种治疗方案中所有使用的RTs(表1)药效不同程度地降低，甚至失效，产生耐药性，而且随着这些药物治疗时间的延长，耐药发生频率趋于升高(表1)，提示长时间使用一种药物或一种治疗方案容易诱发HIV-1 RNA发生适应这些药物的突变，降低病毒抑制效果，与李彦媚[6]等的报道基本一致。

与NRTIs相关的突变中，M184V(19.91%)突变频率最高，其次是T215F(9.52%)、D67N (7.79%)、K65R(7.79%)、L210W(6.49%)、V75I/T(6.49%)、M41L(4.76%)等(表2)。针对NNRTIs的耐药基因突变中，耐药发生频率最高的突变位点是K103N和Y181C，均为9.96%，其次是V108I(4.76%)等(表3)。与Joao等的报道相比[7]，逆转录酶编码区位点突变相似，但位点突变频率低。有23.81%(55/231)的患者出现了3TC和FTC高度、中度或低度耐药，低于李彦媚的89%的报道[6]，这是M184V、K65R和T69D突变的作用结果。有20.35%(47/231)的患者在210、215位点发生突变，导致ABC、AZT、D4T、DDI和TDF中度或低度耐药，明显高于黄丹关于男男性接触者耐药监测结果[8]。非核苷类逆转录酶编码区的突变可造成EFV、 ETR、NVP、RPV发生高度、中度或低度耐药，其中Y181C引起其高、中度耐药，有11.69%(27/231)患者的K103N、Y188L或G190S突变使EFV、NVP高度耐药，ETR潜在低度耐药。在同一突变位点，突变氨基酸类型不同，耐药种类和耐药程度也不同，例如K103N与K103S、G190A与G190S、V179E与V179D等。逆转录酶编码区的位点突变足以导致临床常用药物的病毒学治疗失败[3]。本次研究显示治疗方案中没有使用的逆转酶抑制剂TDF、ETR、RPV出现了中低度耐药和蛋白酶抑制剂ATV/r、FPV/r、IDV/r潜在低度耐药，提示我们药物诱发突变是抗病毒治疗失败的主要原因，同时推测交叉耐药和某些自然突变也可导致药物灵敏性降低。本次研究证明蛋白酶抑制剂对我们的研究对象还具有一定抑制作用。

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HIV-1 RNApolgene mutation among patients infected with HIV through sex behaviour after antiretroviral therapy

LU Xin-li,ZHAO Hong-ru,WANG Wei,ZHAO Cui-ying,BAI Guang-yi,ZHANG Yu-qi,LI Yan,WANG Ying-ying,CHEN Su-liang

(CenterforDiseasePreventionandControlofHebeiProvince,Shijiazhuang050021,China)

In this study, we investigated the prevalence of HIV-1 drug resistance among patients infected with HIV through sex behaviour who were receiving highly active anti-retroviral therapy (HAART) in Hebei Province. Plasma samples were collected from patients who were infected with HIV through sex behaviour. Then the detection of HIV-1 genotype was implemented, and HIV drug-resistance mutations were analyzed. Results indicated that 68 of 231 patients, infected with HIV-1 by sex transmission, occurred drug-resistance mutation. The rate of the drug resistance was 29.44% (68/231). The rate of resistance to RTs (29.00%, 67/231) was much higher than that of PIs (0.87%, 2/231). Therefore, the main causation which resulted in therapic failure was drug-induced mutation. The detection of HIV drug resistance throughout HAART was useful so that we could make the better plan of highly active anti-retroviral therapy (HAART).

HIV; sexual contact; highly active anti-retroviral therapy; drug-resistance mutation

Chen Su-liang, Email: hebeicdc2013@sina.com

陈素良，Email：hebeicdc2013@sina.com

河北省疾病预防控制中心，石家庄 050021

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.012

R511

A

1002-2694(2015)01-0053-04

2014-05-13；

2014-10-29

河北省医学科学研究重点课题计划(20120256)

Supported by the Medical Science Research Plan of Hebei Province (No. 20120256)