医疗机构使用中消毒剂的微生物污染检测及消毒剂供试品无菌检验的分析

2015-01-26 22:19祝艳云曹萍
中国卫生产业 2015年32期
关键词:肉汤培养皿恒温

祝艳云,曹萍

吉林省敦化市疾病预防控制中心,吉林敦化 133700

为了掌握该市各级医疗机构使用中消毒剂微生物污染情况,加强使用中消毒剂的管理,降低院内感染率。在使用现场采集各医疗机构使用中消毒剂,对采集的消毒剂进行污染菌检测;《医疗卫生消毒标准2012版 (合订本)》。

1 资料与方法

1.1 样品采集

用无菌方法采取被检消毒药10 mL,加入到20 mL无菌试管中,4 h内送检。

1.2 检验过程

1.2.1 菌落总数测定 (1)样品处理:用无菌吸管吸取消毒液1.0 mL,加入到9.0 mL含相应中和剂的无菌生理盐水中,震荡20 s或80次,取1:10稀释液进行检测。

(2)实验步骤:利用灭菌后的吸管提取稀释10倍的检测液,共提取2 mL,将检测液分别注入两个消毒后的培养皿上(每份1 mL)。然后再取去同样的检测液1 mL,将其加入到9 mL的无菌生理盐水当中,充分震荡约20 s后制成稀释100倍的检测液,再提取2 mL该检测液,将其分别注入两个消毒后的培养皿内。选择普通琼脂放入水浴锅中融化,待其冷却到50℃左右后倾倒在各培养皿上,每个培养皿内倾倒约15 mL,倾倒后立即摇动培养皿,使内部的琼脂能够与检测液充分的缓和。待琼脂完全凝固后可采用倒置培养方法,恒温培养箱的温度设定为36℃,培养时间为48 h。另外选择一个空白无菌培养皿,将制备的琼脂倒入其中,待自然凝固后放入恒温培养箱内,温度和培养时间与检测液相同,作为对照组。

(3)实验报告:在培养完毕后利用肉眼对培养皿中菌落的数量进行观察,在完全记录菌落数量后,将其放在5~10倍的电子放大镜下进行复查,提高菌落计数的准确率。记录同一稀释浓度下培养皿内菌落的数量,取平均值作为菌落生长数。选择其中菌落生长数量在30~300之间的培养皿,将菌落数与1 mL消毒剂内所含有的菌落数量相乘,单位设定为CFU/mL,如果一个稀释度内无病菌生长,其报告内菌落指数应低于10 CFU/mL。

1.2.2 霉菌、酵母菌的测定 (1)实验步骤:选取稀释度为10倍、100倍和1 000倍的检测液1 mL,分别将其注入到无菌培养皿中,每个稀释度检测液各放入两个培养皿中。选择沙堡罗琼脂放入水浴锅内融化,在温度冷却到45℃时,将琼脂倒入培养皿当中,并立即进行摇动混匀,采用倒置方法在恒温培养箱内进行培养。培养箱内温度设定为28℃,培养时间为72 h,在培养结束后详细记录培养皿上霉菌和酵母菌的数量。另外需要选择一个未添加检测液的无菌培养皿,将沙堡罗琼脂倒入培养皿内,并在琼脂凝固后放入恒温培养箱当中,温度和培养时间也检测液相同,作为对照组。

(2)实验报告:先对每一个培养皿上生长的菌落数量进行统计,并计算每个稀释浓度菌落数量的平均值,选择菌落生长数量在5~50的培养皿,将菌落数与稀释倍数相乘,所得结果即为每毫升消毒剂当中所含有的霉菌和酵母菌的总数。

1.2.3 致病菌的检测 (1)金黄色葡萄球菌的检测:①病菌培养方法:选择稀释10倍的检测液,将其加入两倍浓缩的氯化钠肉汤当中,该肉汤的浓度为7.5%,其中检测液共10 mL、肉汤10 mL。将该培养皿放入恒温培养箱中进行培养,温度设定为36℃,培养时间为24 h。②病菌分离培养:利用接种环将培养皿当中的病菌取出,采用划线法进行接种,培养基为血琼脂培养基。将该培养基同样放置在温度为36℃的恒温培养箱内培养,培养时间为48 h。金黄色葡萄球菌通过血琼脂培养后整体呈金黄色,菌落大而突出,外形为光滑圆形,并且在菌落周围可见明显的溶血圈。利用接种环挑取单个菌落进行分离提纯,采用同样的温度培养24 h。③菌落染色和镜检:选择分裂提纯培养后的菌落进行涂片,利用革兰氏染色法,金黄色葡萄球菌呈阳性,在电子显微镜下其菌株排列成葡萄状,并无芽孢分布,具有致病性的葡萄球菌个体较小,一般直径在1μm以下。④甘露醇发酵试验:选择分离培养后的菌株,将其接种在含有甘露醇的琼脂培养基上,在温度为36℃的环境中培养24 h,能够使甘露醇发酵并产生酸性物质者判断为阳性。⑤血浆凝固试验:选择稀释4倍的人新鲜血液0.5 mL,将其加入到无菌试管当中,并加入通过肉汤培养的检测菌落0.5 mL,充分混匀后放入恒温培养箱内,温度设定为36℃,每隔0.5 h观察1次试管,如果试管内血液在6 h内出现凝块情况,则判断其为阳性。⑥实验报告:该次实验当中所生长的菌落,通过染色和镜检之后,如为金黄色则判定为革兰氏阳性葡萄球菌,其能够对甘露醇产生发酵反应,并且凝血实验也呈阳性,说明检出菌落为金黄色葡萄球菌。

(2)铜绿假单胞菌的检测:①病菌培养:选择稀释度为10倍的检测液10 mL,将其接种在普通肉汤当中,该肉汤共浓缩2倍,剂量为10 mL,将检测液放置在36℃环境中进行培养,培养时间为24 h。如肉汤上方生成一层菌膜,并成黄绿或蓝绿色,则说明有铜绿假单胞菌生成。②病菌分离培养:利用接种环挑取菌落,采用划线法接种在培养皿上,该培养基的昂中含有十六烷三甲基溴化铵,将培养皿放置在36℃环境下培养24 h。该菌落生长无明显形状,以向四周随机蔓延为主,菌落表面湿润,颜色为灰白色,菌落周围还可见明显的水溶性色素,颜色为绿色。③染色镜检:在培养皿当中挑取菌落,革兰氏染色后呈阴性的,可以开展氧化酶实验。④氧化酶实验:选择无菌白色滤纸放置在平皿底部,利用接种环将菌落涂抹在滤纸上,然后加入1%的二甲基对苯二胺试剂,如果在30 min内菌落颜色变为粉色,则说明氧化酶反应阳性,反之则为阴性。⑤绿脓菌素试验:选择菌落2~3个,将其接种在绿脓菌素鉴定培养基上,放置在恒温培养箱内培养,温度设定为36℃,时间为24 h。培养结束后选择氯仿约5 mL加入培养皿,充分震荡混合,使绿脓菌素能够溶解在氯仿当中,此时如果试剂变为蓝色,则将试剂转移到空试管内,并加入1 mL盐酸,震荡后如果溶液上层为粉红色,则判断为阳性。⑥硝酸盐还原产气试验:接种环挑取菌落,将其接种在含有硝酸盐蛋白胨的水培养基当中,同样放置在温度为36℃的恒温培养箱内,培养时间为24 h。培养后如果小试管有气体产生,则判断为阳性。因为铜绿假单胞菌能够将亚硝酸盐还原,并生成氮气。⑦明胶液化试验:对菌落进行提纯培养,并采用穿刺接种的方式,将其接种在明胶培养基内部,放置在培养箱内24 h,培养完毕后直接放入冰箱保鲜层,大约0.5 h,如果取出后明胶呈液化溶解状态,则说明呈阳性,反之呈阴性。⑧实验报告:经过分离提纯染色检查后,证明检测液中含有革兰氏阴性菌,氧化酶和绿脓菌素的实验结果均呈阳性,说明其中含有铜绿假单胞菌。而如果绿脓菌素实验呈阴性,而液化明胶、硝酸盐还原实验均呈阳性,则仍可说明其中含有铜绿假单胞菌。

(3)乙型溶血性链球菌的检测:①病菌培养:选择稀释度为10倍的检测液10 mL,将其接种在含有浓度2倍的肉汤当中,该肉汤中含有葡萄糖,放置在36℃的恒温培养箱内,共培养24 h。②病菌分离培养:用接种环挑取培养后的菌落,采用划线接种方式,将其接种在血培养基中,同样放置在36℃环境下,共培养24 h。该菌种在血培养基上生长的菌落颜色为灰白色,通常称不透明状态,菌落顶端具有针状突起,并且边缘光滑整齐,在菌落周围还存在明显的溶血圈。③染色镜检:接种环挑取菌落,革兰氏染色后呈阳性,在镜检下菌落排列呈链状。④触酶试验:利用接种环挑取菌落中心的菌体,将其接种在空载玻片上,选择胶头滴管在病菌上滴入浓度为30%的双氧水,放置顺序不可互换,否则会引发假阳性反应。观察载玻片上是否有气泡产生,如有气泡则视为阳性,而乙型溶血性链球菌应呈阴性。⑤链激酶试验:将0.02 g的草酸钾与人体5 mL新鲜血液进行混合,经过充分离心后提取上清液备用。在草酸钾血清中注入0.8 mL无菌生理盐水,充分震荡混合,然后将肉汤内培养的菌落加入试管中,并同时加入0.25 mL的氯化钙试剂。将试管放入温度为36℃的水浴锅内进行孵化,每隔2 min对凝固程度进行观察,在凝固后记录血清的融化时间,如果凝固后2 min不出现融化情况,则将试管转移到恒温培养箱内培养24 h,培养后如血清融化,则说明为阳性。⑥杆菌肽敏感试验:将菌落接种在血培养基上,利用消毒后的镊子夹取含有0.04单位的杆菌肽试纸,并放入恒温培养箱内,如果培养24 h后出现明显抑菌带,则判断为阳性。⑦报告:被检消毒剂经增菌培养后,经证实为革兰氏阳性、呈链状排列的球菌,触酶阳性、链激酶试验阳性、对杆菌肽敏感者,即可报告为检出乙型溶血性链球菌。

2 结果

经检测,21个被检医疗机构的43个科室的使用中消毒剂合格率为82.6%,醇类消毒剂的合格率为92%,过氧化物类为79.3%,含氯消毒剂为97.6%,碘类消毒剂为98%,醛类消毒剂为76%,酚类消毒剂为99%;菌落总数超标率为5.5%,霉菌和酵母菌检出率为1.3%,金黄色葡萄球菌检出率为2%,铜绿假单胞菌检出率为0.8%,乙型溶血性链球菌检出率为1%,有些重要科室如产房,口腔科等重要科室,使用中消毒剂微生物污染严重,合格率较低[1]。

3 讨论

对使用中消毒剂的配制和使用要做到:盛装消毒剂的器皿在消毒剂配制前应进行消毒灭菌(高压蒸汽灭菌或高温干燥灭菌),消毒剂配制过程中要无菌操作;使用前应认真阅读产品包装上的产品说明、使用范围、使用方法和注意事项等,并严格遵照执行;消毒剂应放置于阴凉通风处,避光、防潮、密封保存;按产品说明,根据有效成分含量按稀释定律配制所需浓度;多数消毒剂配置后稳定性下降,要现用现配、使用前监测浓度。连续使用的消毒剂要每日监测浓度,或每次使用前监测浓度;用过的医疗器械和物品,应先去除污染,彻底清洗干净再消毒;用于浸泡消毒时容器应加盖,并放于通风良好的环境中;消毒剂均有一定的腐蚀性,不宜长时间浸泡物品或残留在物体表面,作用时间达到后要取出并采取有效措施去除残留消毒剂;消毒人员要做好个人防护[2]。

对使用中的消毒剂要加强管理,对不合格的医疗机构监督整改,定期对使用中消毒剂进行抽样检测,对降低院内感染率,避免重大院内感染事故的发生,有着非常重要作用[3]。

[1]刘彩霞,等.医院使用中消毒剂的监测结果分析与管理[J].中华医院感染学杂志,2012,22(4):64-65.

[2]李晓娟,张以梅.消毒供应中心去污区个人防护依从性的调查与分析[J].中华医院感染学杂志2015(20):4790-4791.

[3]苏晶静.探讨供应室护理质量控制对降低院内感染的可行性 [J].中国卫生标准管理,2015(11):224-225.

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