基于T-RFLP技术的拙政园土壤微生物多样性分析

吴琼，陈紫丹，邱业先

（苏州科技学院化学生物与材料工程学院，江苏苏州215009）

基于T-RFLP技术的拙政园土壤微生物多样性分析

吴琼，陈紫丹，邱业先*

（苏州科技学院化学生物与材料工程学院，江苏苏州215009）

采集拙政园3个底泥和3个土壤样品，运用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术分析拙政园6个样品的微生物多样性。研究结果显示：底泥细菌中T-RFs片段大小为181 bp、211 bp的菌种为优势菌种，土壤细菌中T-RFs片段大小为91 bp、205 bp的菌种为优势菌种。各样点底泥的真菌种类各不相同，且种类较少，无明显的优势菌种，而土壤真菌中T-RFs片段大小为355 bp的菌种为优势菌种。这说明拙政园底泥、土壤的细菌和真菌多样性存在差异，细菌多样性明显高于真菌。为苏州园林微生物多样性及群落结构累积了有价值的资料。

拙政园；微生物多样性；末端限制性片段长度多态性；底泥；土壤

拙政园始建于明正德初年，占地约5.2 hm2，距今已有500多年历史，1961年被国务院列为全国第一批重点文物保护单位，是江南古典园林的代表作品之一。1997年拙政园被列入《世界遗产名录》。近年来，拙政园的游客接待量屡创新高，这一现象对拙政园的生态环境产生严重影响，但对其微生物生态变化鲜有研究报道。末端限制性片段长度多态性（Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技术，可用微生物基因组不同长度DNA片段代表不同类型的微生物，显示的峰高或峰面积一定程度上代表了该种微生物类型片段的丰度[1]。T-RFLP技术作为一种研究微生物群落多态性的方法被越来越多的运用在环境微生物研究中。该技术因其可重复性高、周期短、高通量等特点[2]被广泛运用于环境微生物群落结构及变化等生态学研究中，比如海洋[3]、土壤[4]等。

广义上土壤包括了土壤以及底泥。底泥微生物包括细菌、古菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类，是湖泊等水体沉积物中一切看不见或者看不清楚的微小生物的总称[5]。底泥微生物是水体生态系统物质循环和能量流动的主要动力，底泥中微生物物种、基因等资源的鉴定和获得有助于丰富当前对微生物资源的认知，有助于从侧面了解水质演化历史[6]。土壤是生态系统的重要组成部分，是微生物栖息的大本营。土壤物质组成、理化过程和微环境的高度异质性，导致土壤被认为是地球上“微生物多样性”最丰富的环境[7]。因此，要研究拙政园生态系统的多样性和群落结构，对土壤微生物的研究是必不可少的。然而环境中大部分微生物不能通过传统的纯培养获得，只有运用宏基因组学的方法绕过纯培养来研究环境微生物多样性与群落结构。因此，笔者采用T-RFLP等技术针对拙政园水系底泥、土壤中细菌、真菌的多样性及群落结构展开研究，旨在了解拙政园土壤微生物多样性，为环境监测预警和评价提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料

DNA抽提试剂盒、Taq PCR Master Mix、DNA胶回收试剂盒购自上海生工；EDTA-Na2、溴化乙锭等均为国产分析纯。

1.1.2 仪器

小型台式高速离心机（5417R，德国Eppendorf），凝胶成像分析仪（Universal Hood II，美国Bio-Rad PCR扩增仪5332），德国Eppendorf恒温水浴锅（HH·S21-4-S，上海精宏）。

1.2 方法

1.2.1 采样

样本于2014年3月28日采自江苏省苏州市拙政园，选择了6个地点采样，分别采集各样点的底泥和土壤。底泥采用取样器取自湖泊支干、中心及主干的河道，土壤取自园内树根、空地、草根周围的土壤。湖泊底泥用采样器取湖泊0-10 cm底泥，土壤采集表层土，深度为0-5 cm，充分混匀装入塑料封口袋，避光储存，带回实验室进行分析。

1.2.2 DNA提取和PCR扩增

DNA提取：采集的各样品用基因组DNA抽提试剂盒（上海生工，SK8263）提取总DNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外成像均出现明亮条带。将提取的DNA在-20℃的条件下保存待用。PCR扩增：采用针对细菌16SrRNA的特异性引物FAM-27F和1495R进行PCR扩增，其中27F的5‘端用荧光标记。引物序列为：FAM-5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’[8]。采用真菌ITS区通用引物ITS1-F和ITS4，其中ITS1-F的5’端用荧光标记，引物序列为：FAM-5’-CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA-3’，5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[9]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。细菌PCR反应体系为：12.5 μL 2×Taq Master Mix，9.5 μL ddH2O，Primer1（27F）、Primer2（1492R）和模板DNA各1 μL。真菌PCR反应体系为：10 μL 2×Taq Master Mix，6 μL ddH2O，3 μL模板DNA（稀释50倍），Primer1（ITS1-F）和Primer2（ITS4）各0.5 μL。

细菌PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环，72℃延伸10 min，4℃保存；真菌PCR：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共40个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反应程序为扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用DNA胶回收试剂盒（上海生工，SK8131）进行割胶纯化，纯化产物经1%琼脂糖凝胶电泳电泳检测。

1.2.3 T-RFLP分析

采用HhaⅠ（上海生工，FD1854）和HaeⅢ（上海生工，ER0151）两种限制性内切酶双酶切细菌PCR产物。采用HhaⅠ（上海生工，FD1854）限制性内切酶酶切真菌。PCR产物。然后，37℃下温浴1 h，80℃下处理20 min使酶失活。最后将酶切产物送至上海基康生物技术有限公司进行基因扫描。

1.3 数据分析

所有样品的T-RFLP图谱用Peak Scanner Software v1.0软件进行分析，选择的内标是500-250liz和sizing defalt-pp，去除片段大小小于50 bp或大于500 bp和荧光强度小于50荧光单位（FU）峰面积低于总峰面积0.5%的T-RFs[10]。峰值图上峰所对应的横坐标代表T-RF的片段长度，纵坐标代表含有荧光物质T-RF的荧光强度；峰面积则代表具有相同片段长度的T-RF荧光强度之和，即它所代表的该菌种的相对数量[11]。物种丰度（Species Richness）为：S=T-RFLP图谱中显著峰的总数。由于每一种细菌的T-RF长度是唯一的，所以粗略地认为每个峰对应着一个不同的物种。多样性指数包括丰度香农指数（Shannon index）、辛普森指数（Simpson index）、均匀度指数（Evenness index）[12]，用SPSS19.0进行聚类分析，根据公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）计算样品之间Sorenson的相似性系数，其中N（A+B）指两样品共有的部分，NA、NB指两样品各自包含的部分。

2 结果与分析

2.1 拙政园底泥、土壤细菌的PCR扩增结果分析

以提取的拙政园6个样点的底泥、土壤的基因组DNA为模板，分别采用针对细菌16SrRNA的特异性引物、真菌ITS区通用引物进行扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1、图2。细菌获得了长度约为1 500 bp的目的条带，真菌获得了长度约为600 bp和1 000 bp的目的条带。

图1 底泥、土壤16srRNA细菌的PCR电泳图

图2 底泥、土壤16srRNA真菌的PCR电泳图

2.2 拙政园底泥、土壤的T-RFLP分析

利用HhaⅠ和HaeⅢ两种限制性内切酶双酶切拙政园底泥、土壤细菌PCR产物，HhaⅠ酶切真菌PCR产物，T-RFLP分析结果见图3、图4。从图3可以看出酶切谱带明显，细菌的T-RFs片段大小在56-330 bp之间。真菌的T-RFs片段大小在51-380 bp之间，底泥、土壤细菌、真菌群落均存在差异。表1、表2列出了底泥、土壤细菌T-RFs长度及其优势长度，与图3、图4结果一致，即峰面积较大的为优势类群。细菌的数量表现为：支干底泥＞主干底泥＞中心底泥，空地土壤＞草根土壤＞树根土壤；真菌的数量表现为：中心底泥＞主干底泥＞支干底泥，树根土壤＞草根土壤＞空地土壤，结果表明各系统群落呈现出多样性。

图3 底泥、土壤细菌的T-RFLP图谱

图4 底泥、土壤真菌的T-RFLP图谱

表1 基因组DNA检测细菌T-RFs长度

表2 基因组DNA检测真菌T-RFs长度

2.3 拙政园底泥、土壤微生物多样性分析

拙政园底泥、土壤细菌、真菌的香农多样性指数、辛普森指数、均匀度指数见表3、表4。由表3可知，各样点细菌香农指数在3.119-3.486之间，辛普森指数在0.926-0.963之间，均匀度指数在0.864-0.945之间，各指数相差不大，说明拙政园各样点细菌多样性均匀且多样性较高。表4是真菌群落的多样性指数，对应的香农指数、辛普森指数均低于细菌，真菌多样性不高，均匀度也存在差异。这一结果说明底泥中可能以厌氧菌居多，真菌种类较少，多样性较低。

表3 底泥、土壤细菌群落的多样性指数

表4 底泥、土壤真菌群落的多样性指数

2.4 拙政园底泥、土壤微生物相似性分析

拙政园底泥、土壤细菌、真菌群落相似性系数见表5、表6。细菌群落相似性系数在0.091-0.517之间，真菌群落相似性系数在0-0.489之间。细菌中，支干底泥和中心底泥相似性系数最高，为0.517；其次是空地土壤和草根土壤，为0.330；再次为支干底泥和空地土壤，为0.263。总体上底泥细菌相似性高于土壤细菌相似性，原因在于底泥与上覆水之间存在交换作用，各样点底泥微生物之间交互流动，是一个整体系统，微生物多样性比较一致。而各样点土壤空间上是分隔开来的，微生物多样性会存在较高差异。真菌中，底泥的真菌种类较少，相似性几乎没有。在土壤中，真菌相似性在0.005-0.489之间，存在一定相似性。树根土壤与草根土壤相似性最高，原因在于其环境相似，存在的菌种也具有相似性。

表5 底泥、土壤细菌群落相似性系数

表6 底泥、土壤真菌群落相似性系数

3 讨论与结语

拙政园作为苏州园林的典型代表之一，为世人所喜爱。近年来，随着气候、游客量等客观因素的影响，其生态环境及微生物种群等受到一定的影响。但国内外均未见相关的研究报道。笔者首次采用T-RFLP技术分析拙政园底泥和土壤的细菌、真菌多样性与群落结构。

T-RFLP技术因重复性、高通量等优势，在微生物多样性研究中发挥重要作用。如Trabelsi D等[13]采用TRFLP技术研究了菜豆接种根瘤菌对土壤细菌群落的影响。Scavino A F等[14]运用T-RFLP技术研究了乌拉圭牧场和灌溉稻田的土壤中产甲烷微生物群落的结构和功能。虽然T-RFLP技术在微生物多样性研究中广泛应用，但目前未发现在园林环境微生物研究方面中采用T-RFLP技术。

该研究采用T-RFLP技术分析了拙政园底泥、土壤6个采样点的细菌、真菌多样性与菌落结构。6个采样点之间微生物多样性与群落结构存在差异，不同采样点的底泥、土壤微生物多样性与群落结构也不相同。细菌中，支干底泥优势T-RFs长度为205 bp、211 bp、213 bp、231 bp，中心底泥优势T-RFs长度为181 bp、183 bp、197 bp、211 bp，主干底泥优势T-RFs长度为181 bp、191 bp、206 bp、209 bp，底泥中181 bp、211 bp分别是两个样点的优势菌种，表明拙政园湖泊底泥的优势菌种为181 bp、211 bp所代表的菌种。树根土壤优势T-RFs长度为176 bp、179 bp、189 bp、192 bp，空地土壤优势T-RFs长度为91 bp、205 bp、210 bp、231 bp，草根土壤优势T-RFs长度为59 bp、91 bp、205 bp、233 bp。真菌中，支干底泥优势T-RFs长度为268 bp、269 bp；中心底泥优势T-RFs长度为273 bp、380 bp，主干底泥优势T-RFs长度为320 bp、348 bp，树根土壤优势T-RFs长度为327 bp、355 bp，空地土壤优势T-RFs长度为92 bp、355 bp，草根土壤优势T-RFs长度为341 bp、355 bp。底泥各样点的真菌种类各不相同，土壤中T-RFs片段大小为355 bp的菌种为优势菌种。各样点细菌多样性指数相差不大且都比较高，说明拙政园各样点细菌有丰富的多样性。其中草根土壤的细菌各项多样性指数均为最高，表明草根周围土壤营养丰富，适于细菌生存，环境最优。各样点真菌的香农指数、辛普森指数都比较低，且都低于同一样点的细菌多样性指数，表明真菌多样性不高，均匀度差异也较大。这一现象的原因可能是底泥中氧含量常年较低，以厌氧菌居多，真菌种类较少；而土壤中细菌多样性高于真菌是由于土壤中细菌数量占土壤微生物总量的70%到90%，土壤是各种微生物生活的大本营，据估计1 g土壤中有4 000-7 000种近10亿的细菌，生物量可达300-30 000 kg·hm-2[15]，这一结果与以往的研究结果是吻合的。该研究对分析苏州园林微生物多样性和群落演替累积了重要资料。

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T-RFLP analysis of soil microbial diversity in Humble Administrator's Garden

WU Qiong，CHEN Zidan，QIU Yexian
（School of Chemistry，Biology and Material Engineering，SUST，Suzhou 215009，China）

Terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)technique was used to analyze microbial diversity in 3 points of sediment and 3 points of soil in Humble Administrator's Garden.The results show that among the sediment bacteria，T-RFs fragments with the sizes of 181 bp，211 bp were the dominant bacteria.A-mong soil bacteria，T-RFs fragments with the sizes of 91 bp，205 bp were the dominant bacteria.Among sediment fungi，species of each site were not identical.Among soil fungi，T-RFs fragment with the size of 355 bp was the dominant fungus.Bacterial and fungal diversity of sediment and soil in Humble Administrator's Garden were different.Bacterial diversity was significantly higher than that of fungi.This study has provided valuable data for microbial diversity and community structure of Suzhou gardens.

Humble Administrator's Garden；microbial diversity；T-RFLP；sediment；soil

Q33

A

1672－0687（2015）03－0036－07

责任编辑：李文杰

2015－01－23

吴琼（1990-），女，江苏泰州人，硕士研究生，研究方向：生物催化转化。

*通信联系人：邱业先（1954-），男，教授，博士，硕士生导师，E-mail：qyx542@163.com。