诱导型一氧化氮合酶/环氧合酶2 在女性压力性尿失禁中的研究进展

杨智明综述，方克伟审校

0 引 言

诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是催化精氨酸合成一氧化氮(nitric oxide，NO)的关键酶，在体内多种细胞内表达，催化产生的NO 既是一种新的第二信使神经递质，也是一个活性很强的自由基，在体内广泛参与多种病理生理过程，如调解血管张力、参与神经传递、介导炎症反应和免疫反应等。环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)是花生四烯酸代谢过程中前列腺素(prostaglandins，PGs)合成的限速酶，是一种膜结合蛋白，存在于核膜和微粒体膜中。合成的PGs 产物对维持机体的病理生理过程有重要作用，如参与免疫炎症反应、缺血、损伤、肿瘤的形成等。两者对人类下尿路(lower urinary tract，LUT)的生理病理活动起调控作用。女性压力性尿失禁(female stress urinary incontinence，FSUI)是一种严重影响女性身心健康及生活质量的常见疾病，FSUI 发病机制复杂，与多种因素相关，已经涉及到分子机制学说。越来越多的研究表明，iNOS/COX-2 与FSUI 的发病密切相关。因此，研究iNOS/COX-2 在FSUI 发生、发展中的作用，有目的的调控其功能，寻找新的FSUI 治疗靶点，对FSUI 的防治具有重要的生物学意义及临床应用价值。

1 iNOS 与COX-2 的生物学特性

1.1 iNOS 的生物学特性 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是催化精氨酸合成NO 的关键酶，在体内多种细胞内表达。NOS 广泛存在于神经系统，其同功酶有3 种亚型，即在正常状态下表达的神经元型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶以及在损伤后诱导表达的iNOS。神经元型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶合成结构型NOS，主要存在于上皮、脑和血小板，其活性为钙和钙调节蛋白(CaM)依赖性，受细胞内钙离子(Ca2+)浓度生理性调节，通常诱导型和神经元型一氧化氮合酶有神经毒性作用，内皮型一氧化氮合酶有神经保护作用。它们在组织分布、调节方式、生物活性和NO 产量方面都有区别。NO 既是一种新的第二信使神经递质，也是一个活性很强的自由基，广泛参与体内多种生理病理过程，如调解血管张力、抑制血小板聚集和黏附、参与神经传递、参与阴经勃起、排尿控制、介导炎症反应和免疫反应等，NO 具有双重作用，在体内表现为生理还是病理作用取决于NO 的浓度，NO 正常时为生理作用，过高时为病理作用，这取决于NOS 基因表达的是否正常［1］。如研究表明在心血管系统，生理剂量的NO 对心肌起保护作用，NOS 基因表达增强产生过高的NO 则会引起心肌损伤，而NOS 基因表达减弱产生过低的NO 则会引起动脉粥样性疾病［2-3］。

iNOS 主要存在于多种炎症细胞中，其基因全长约为37 kb，位于人类17 号染色体着丝粒至长臂11区2 带之间(17cen-q11.2)，编码的蛋白相对分子量为131 000，包含1203 个氨基酸残基。iNOS 为一个260 000 的同源二聚体，无活性的单体需要聚合成二聚体才具有合成NO 的能力。iNOS 一旦合成，其活性为非Ca2+依赖性，但其诱导过程为Ca2+依赖性。正常生理情况下，各组织细胞的iNOS 活性几乎不表达;但病理状况下iNOS 受免疫炎症、肿瘤、缺血损伤等多种刺激的诱导而激活，此酶一旦被诱导激活可持续合成NO，直至底物耗竭或细胞死亡。iNOS 的高表达引起NO 合成增加，参与多种疾病的发病过程［2-3］。研究表明，iNOS 的表达上调可能通过诱导炎症反应参与房颤的发生，脓毒血症时iNOS在心肌细胞中的大量表达，产生过量的NO，可对心肌细胞造成损伤［4-5］。研究发现iNOS 的调节主要包括Ca2+和钙调节蛋白、磷酸化和细胞因子等。iNOS 因与钙调节蛋白的亲和力高，故其活性不受Ca2+调节，而为非钙依赖性，但iNOS 磷酸化后活性降低，会使NO 合成减少。iNOS 的转录调控主要有2 条路径，其一是环磷酸腺苷介导，任何升高环磷酸腺苷的因素都有可能促进iNOS 的表达，主要是在转录水平发挥作用，也不除外有稳定iNOSmRNA 功能;其二是多种细胞因子参与了iNOS 活性的辅助调节，主要为核转录因子介导。如肿瘤坏死因子Ⅱ、肿瘤坏死因子γ、脂多糖可上调iNOS 的活性，白介素1(interleukin 1，IL-1)、IL-10、IL-13 以及转化生长因子β 可下调iNOS 的活性。两条途径有互相补充和协同作用［3，6］。

NO 的作用机制可能如下:NO 通过 一氧化氮/环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)途径，参与体内神经传递的过程及发挥其在组织细胞中多种多样的生物学效应。NO 可以与鸟苷酸环化酶上活性位点中的铁离子相结合，进而使可溶性鸟苷酸环化酶激活，导致了细胞内第二信使cGMP 生成增多，生成的cGMP 激活了依赖cGMP 的蛋白激酶、环化酶及离子通道和磷酸二酯酶等多种途径，在不同的组织及细胞内发挥着重要的作用:如血管舒张、平滑肌细胞增殖受抑等。NO 作用的另一个途径是激活ADP，促进ADP 核糖基直接与受体分子结合。此外，NO 还可以直接结合某些通道发挥作用，如在血管平滑肌细胞膜上，NO 可直接激活钙依赖的钾通道。

1.2 COX-2 的生物学特性 COX 是花生四烯酸(Arachidonic acid)代谢过程中前列腺素(prostaglandins，PGs)合成的限速酶，是一种膜结合蛋白，存在于核膜和微粒体膜中。传统观念认为，COX 有2 种结构亚型，即结构型(COX-1)和诱导型(COX-2)。目前研究证实了COX 存在第3 种同工酶—(cyclooxygenase 3，COX-3)。1999 年Simmons 等首次提出COX-3，曾认为其是COX-2 的变异体［7］。2002年Chandrasekharan 等在犬的大脑皮层中最早发现它是另一种COX-1 的剪接异构体(故又称为COX-1v)，后正式命名为COX-3。与COX-1 相比，其基因只保留了内含子1 的序列，但是不同生物体中内含子1 的核苷酸数目不同，因此其表达产物也各不相同。Chandrasekharan 等［8］认为COX-3 是对乙酰氨基酚解热、镇痛作用的作用靶点。后续研究证实在人类的大脑皮层和主动脉中也发现了COX-3 的存在［9］。COX-1 被认为是“看家基因”，主要存在于正常的组织细胞中，催化产生维持正常生理功能的PGs，保持内环境稳定，对消化道黏膜起保护作用。COX-2 被认为是“早期即刻基因”，主要位于细胞浆内及细胞核周［10］。人类COX-2 基因位于1 号染色体q25.2 ～q25.3，长8.3 kb，含有10 个外显子和9 个内含子，编码604 个氨基酸，含有17 个氨基酸残基的信号肽。过去研究认为:正常生理情况下，COX-2在多数组织内检测不到，只有在炎症、肿瘤等病理状态下受炎性刺激物、损伤、有丝分裂原和致癌物质等促炎介质诱导后，表达增高，参与多种病理生理过程。但越来越多的实验研究表明COX-2 在机体的正常生理活动中也发挥着重要作用，比如:心血管系统中血压的控制与维持起重要作用的是COX-2 而非COX-1［11-12］。COX-2存在于正常动物的生殖系统组织、胃肠组织，也包括人类的膀胱和尿道组织［13］。COX-2 在细胞受到各种刺激时可迅速合成，被认为是“快速反应基因”。COX-2产生部位主要在细胞内质网和核内膜中，刺激COX-2 表达的因子存在于细胞内外，主要包括:机械损伤，细胞因子和生长因子(血小板源性生长因子、血小板活化因子、肿瘤坏死因子等)，促肿瘤剂(对苯二甲酸、聚丙烯酸甲酯等)，癌基因(ras，v2src，KRAS)，人绒毛膜促性腺激素，内皮素，NO 等，这些刺激因子经过一系列信号转导如G 蛋白偶联机制，对苯二甲酸活化的蛋白激酶C 介导的通路以及生长因子受体，Src 活化的酪氨酸激酶介导的通路，而作用于COX-2 的5'旁侧区的转录调控序列，促进COX-2 转录，从而诱导COX-2 的表达。相反，一些因素也可抑制COX-2 的表达，如正常P53 基因的产物，非甾体抗炎药，选择性COX-2 抑制剂，糖皮质激素及一些抗氧化剂等均可抑制COX-2 的表达［14］。COX-2 表达增高，参与多种病理生理过程，其机制是细胞膜磷脂通过磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)途径被水解释放出花生四烯酸，在COX-2 的催化下，合成PGE2，最后产生系列炎症介质，并通过瀑布式级联反应参与机体各生理、病理过程［10］。

1.3 iNOS 与COX-2 的关系 目前研究发现iNOS与COX-2 在组织分布、作用机制等方面表现很相似，共同参与许多生理、病理过程，协同发挥作用。iNOS 与COX-2 两者之间存在“cross-talk”效应，两者特异结合形成一个共同信号传导通路，选择性地打开iNOS/COX-2 的共同信号传导通路将影响NO 介导的COX-2 的活性，这种“cross-talk”的机制可能是:一种可能是NO 通过产生的自由基、促进钙离子内流、抑制细胞呼吸和破坏DNA 等抑制COX-2 的失活，加NO 可与COX-2 的血红素基团结合，增加了COX-2的半衰期，提高了COX-2 的活性。另外一种可能是NO 与超氧化物反应的产物过氧化亚硝基可引起膜脂质过氧化，可使细胞释放花生四烯酸，促进了COX-2的产生。从而产生具有多种生理和病理生理功能的前列腺素，参与炎性反应、有丝分裂和特异性信号传导［15］。同时，COX-2 也促进iNOS 的表达，共同参与疾病的发生、发展［16］。如研究认为iNOS、COX-2 及iNOS/COX-2 在肿瘤的发生、转移及治疗以及心血管、糖尿病损害、脑缺血缺氧病理变化、溃疡性结肠炎等方面都起作用［17-19］。这就意味着iNOS/COX-2在人类许多重大的疾病中扮演重要角色，而人们对此了解尚少。

2 iNOS/COX-2 与FSUI 的关系

FSUI 是一种严重影响女性身心健康及生活质量的常见疾病。近10 年来发病呈逐渐增长趋势，被世界卫生组织列为5 大慢性病之一。根据国际控尿协会(ICS)的定义，FSUI 是指在无膀胱逼尿肌收缩的情况下，膀胱内压超过尿道内压，尿液不自主由尿道外口益处，多在咳嗽、打喷嚏、运动、排便等腹压增大时发生。特点是在正常状态下尚能控尿，而在腹压增高时出现不自主漏尿。流行病学调查研究显示FSUI 与多种发病因素相关，但具体的发病机制尚不明确，近年来人们试图从分子水平阐述FSUI 的发病机制，众多研究发现iNOS 和COX-2 在FSUI 的发生过程中具有重要的作用［20］。

2.1 iNOS 与FSUI 尽管FSUI 的发病机制尚不明确，但神经递质的改变是其重要发病机制之一。非肾上腺素非胆碱能神经递质NO 与压力性尿失禁的发病密切相关［21］，目前认为NO 普遍存在于下尿路(膀胱和尿道)中，尤其是膀胱三角区、膀胱颈和尿道为主，形态学研究已证实NOS 各个亚型存在于人和多种动物下尿路，在其黏膜上皮、血管内皮、平滑肌细胞中也可表达NOS 免疫反应活性［22-23］。NO在尿道移行上皮、血管周围、肌纤维和结缔组织均有显著表达，在血管周围表达最多，其次是移行上皮。NO 在阴道前壁血管周围表达最多，其次是鳞状上皮、腺体、平滑肌、结缔组织。NO 对下尿路的主要调节功能是:维持储尿期膀胱逼尿肌松弛，介导排尿时膀胱颈部平滑肌、尿道括约肌、尿道平滑肌的反射性松弛。NO 是NOS 催化精氨酸的产物。研究表明，阴道分娩或阴道分娩产伤导致了泌尿生殖道局部缺血和炎症反应的发生。泌尿生殖道的局部缺血和炎症反应导致了下泌尿道功能的异常，并且激活了iNOS的表达，诱导产生了大量的NO 化合物，导致下尿路舒张［24-26］。研究表明iNOS mRNA 在更年期女性尿道及阴道组织均有表达［27］。神经解剖学研究已证明尿道富含大量氮能神经元分布，而逼尿肌氮能神经元呈稀疏分布。对于大部分物种，尿道的一氧化氮合酶活性远大于逼尿肌。对猫、鼠和猪的研究均表明NOS 神经元主要存在于尿道和膀胱三角区，而逼尿肌仅有稀疏的神经分布。分别将鼠、兔、猪的膀胱和尿道用NO 或NO 供体处理后对其进行刺激发现膀胱的松弛程度较尿道低［28］。所以NOS 对尿道的作用远大于膀胱，导致膀胱压力大于尿道内压力，从而发生尿失禁。且有研究证实，NOS 活性增高与脊髓损伤后导致的尿失禁有关，使用NOS 抑制剂治疗可改善尿失禁的症状［29］。脊髓损伤后排尿功能障碍，表现为神经源性逼尿肌过度活动及逼尿肌-尿道外括约肌协同失调患者，使用NO 供体药物治疗后尿道外括约肌静息和不协调收缩时压力明显下降，而膀胱压力和反射容积没有改变，可改善患者尿液排空，明显减少残余尿量。iNOS/NO 通路途径是目前尿失禁发病病因及潜在治疗方法的研究重点，它通过神经作用松弛下尿路，最终导致了尿失禁的发生。然而其深层次的发病机制有待于更多的实验研究。

另外，在男性的下尿路，NO 不仅参与了排尿控制［30］，而且还与阴经勃起功能有关。研究发现NOS在男性的膀胱、尿道和阴经海绵体、前列腺中都有表达。动物实验发现大鼠前列腺组织内NOS 基因表达水平随年龄增长而下降，体外实验人前列腺平滑肌接触NO 后出现松弛。NOS/NO 减少致平滑肌细胞增殖，使前列腺结构改变并增强收缩，出现良性前列腺增生，从而影响膀胱出口阻力和膀胱顺应性，导致下尿路症状。勃起功能障碍发病与内皮功能障碍导致的NO 的产生减少或者是功能低下，使阴茎海绵体内血管扩张及平滑肌舒张功能障碍。海绵体组织慢性缺血缺氧，最终导致勃起功能障碍［31-32］。具体相关的机制及NOS 在男性下尿路中的分布及功能机制有待于更多的实验研究。

2.2 COX-2 与FSUI 传统上，COX-2 被认为与许多病理状态相关，在绝大多数正常组织不表达。然而越来越多的例子表明COX-2 也存在于各种正常组织中。研究表明，在正常生理状态下，COX-2 及COX-2mRNA 在犬类动物的下尿路中均有表达，并且COX-2 及催化产生的PGs 产物在下尿路的分布情况与动物的性别及性腺状态有关，COX-2 能够被促性腺激素:黄体生成素和卵泡刺激素刺激表达。动物被切除性腺后，下尿路的COX-2 表达水平下降，可能损害了下尿路的功能，与动物性腺切除后导致的尿失禁发病密切相关。以往的动物模型研究表明，切除性腺的动物与正常动物相比，更容易发生尿失禁，尤其是雌性动物在切除卵巢后发生尿失禁的风险更高。促性腺激素释放激素对动物去势后导致的尿失禁治疗有明显疗效，也暗示了促性腺激素对动物的下尿路功能有重要的生理作用，但其中的机制还尚不明确。促性腺激素作用于下尿路的组织主要为膀胱和尿道，因为大量的黄体生成素受体和卵泡刺激素受体分布于此。PGs 在人和动物的排尿活动中起重要的调控作用，因此COX-2 及黄体生成素受体、卵泡刺激素受体在动物下尿路的共同表达，与促性腺激素刺激COX-2 表达，诱导PGs 化合物的产生有关［33］。PGs 对膀胱的功能及排尿反射的控制起重要作用，PGs 能增强膀胱逼尿肌的收缩，通过2 条途径:①突出前膜的PGs 受体可以诱导乙酰胆碱的释放;②PGs 激活了辣椒辣素敏感的膀胱传入神经纤维，诱导了细胞因子的释放。减少膀胱内PGs 的含量可以减轻膀胱逼尿肌的过度活动［34］。下尿路PGs 含量的过高过低均会导致下尿路功能异常。实验表明膀胱过度活动症中，iNOS 催化的NO 产物和COX 催化PGs 产物均参与了该病的发病过程。在膀胱基底部的逼尿肌存在部分PGs，调节着膀胱传入和传出神经的活性。COX-2 的表达增强产生大量的PGs 产物，刺激了辣椒辣素敏感的膀胱传入神经纤维。释放了大量的神经肽类物质，致使膀胱细胞内iNOS 的活性增高及产生了大量的NO代谢产物。上述一系列的代谢产物的刺激导致了膀胱容积的缩小及排尿次数的增加。并且在膀胱过度活动症患者中使用COX-2 抑制剂能同时抑制COX-2 及iONS 的活性，使用COX-2 抑制剂并不影响膀胱的收缩压力，而是由于抑制了膀胱传入神经纤维的活性，增加了膀胱的容积和顺应性，能减轻膀胱过度活动症的临床症状［35］。研究认为，COX-2 对调控下尿路的功能起重要作用，且使用COX-2 抑制剂作用于正常的下尿路，它可抑制正常的排尿反射活动，甚至会引发急性尿潴留［36］。动物切除性腺后，COX-2的表达水平及相关PGS产物含量下降，对下尿路功能产生负面影响。COX-2 在下尿路的表达水平下降可能与2 个原因有关:①动物被切除性腺后，反射性引起促性腺激素(黄体生成素和卵泡刺激素)释放，使动物体内血中促性腺激素处于长期处于高浓度水平，导致动物下尿路膀胱和尿道中黄体生成素受体和卵泡刺激素受体浓度的下降。②动物切除性腺后，体内性激素水平的下降有关，然而其具体机制有待于进一步的深入研究［37］。COX-2/PGs 通路途径在压力性尿失禁的发病中越来越受到重视。其在压力性尿失禁疾病的发生、发展中所扮演的角色有待于更多的实验研究。

另外，在男性泌尿系的前列腺组织中也有COX-2的表达，研究表明在良性前列腺增生患者的前列腺组织中COX-2 及COX-2mRNA 的表达均增强，在上皮组织上皮细胞尤甚，COX-2 的表达增强与良性前列腺增生的发病有关，其机制是:①是COX-2 高表达诱导产生了大量的PGs，尤其是PGE2;②是COX-2 上调了抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，导致前列腺细胞凋亡减少。具体相关的机制及COX-2 在男性下尿路中的分布及功能机制有待于更多的实验研究［15，38］。

3 展 望

FSUI 是一种严重影响女性身心健康的常见疾病，发病呈年轻化趋势，发病机制复杂，分娩损伤及绝经是其发病的重要因素。近年来人们正在努力从分子水平阐述FSUI 的发生发展机制，其中iNOS/COX-2 信号通路越来越受到重视，在炎症性病变、肿瘤、免疫性疾病等多种疾病中都有异常表达，在疾病的发生、发展中具有重要作用。而iNOS 与COX-2两者之间存在“cross-talk”效应，iNOS 可上调COX-2的表达，COX-2 也促进iNOS 的表达，共同参与多种疾病的发生与发展。以往研究表明:在扩张阴道模拟产伤建立的压力性尿失禁动物模型中，iNOS/NO信号通路表达增强;在切除卵巢后，雌激素水平下降模拟人类绝经建立的压力性尿失禁动物模型中，COX-2/PGs 信号通路表达减弱，并分别简单阐述了各自的分子机制［39-40］。但在人类FSUI 发病中，往往是多种因素(年龄、分娩产伤、绝经、手术史、外伤等因素)混杂在一起，因此iNOS、COX-2 及iNOS/COX-2 信号通路在多病因导致的FSUI 中的发病机制需要更多的实验研究来阐明。这不仅为FSUI 的治疗提供了一个重要靶点，也为新药的开发和研究提供了理论基础和研究思路。

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