柚皮苷的大鼠血浆蛋白结合率研究

李季泓



·药学研究·

柚皮苷的大鼠血浆蛋白结合率研究

李季泓

目的 研究柚皮苷的大鼠血浆蛋白结合率。方法使用平衡透析法模拟柚皮苷在体内与血浆蛋白结合的过程，并建立测定柚皮苷的高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)方法，测定低、中、高3个浓度(100、600、3 600 ng/mL)的柚皮苷在透析袋内血浆中和透析袋外缓冲液中的浓度，计算血浆蛋白结合率。结果低、中、高3个浓度的柚皮苷在体外与大鼠的平均血浆蛋白结合率分别为91.5%、90.5%和96.3%，3个浓度之间的血浆蛋白结合率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论柚皮苷与大鼠血浆蛋白高度结合。

柚皮苷；血浆蛋白结合率；大鼠；平衡透析法

0 引言

柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科植物，同时也是化橘红、骨碎补、枳实等中药的主要有效成分之一[1]。研究表明，柚皮苷具有降脂、抗肿瘤、解痉、镇痛、调节血糖等药理作用[2-6]。柚皮苷在体内可通过与肠内P-糖蛋白交互作用影响药物的吸收，还能影响细胞色素P450的活性，从而影响此酶相关底物的代谢[7]。

血浆蛋白结合率是药物代谢过程中的一个重要参数之一，目前关于柚皮苷的血浆蛋白结合率研究的文献报道很少。本研究采用平衡透析法研究了柚皮苷的大鼠血浆蛋白结合率，为进一步阐述柚皮苷的体内代谢行为和药效学提供了依据，同时为进一步提高以柚皮苷为主要活性成分的药物的临床合理应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Thermp TSQ Quantum Access液相色谱质谱联用仪，配有电喷雾离子化源(ESI)(美国Thermo公司)；Sigma冷冻离心机(德国Sigma公司)；MD25透析袋，截留范围8 000～14 000(北京鼎国生物技术有限责任公司)。柚皮苷对照品(110722-200309，纯度>98%，中国药品生物制品检定所)；橙皮苷对照品(110721-200211，内标，中国药品生物制品检定所)。乙腈、甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)；纯净水由MilliQ纯水制备系统制备；其余试剂均为分析纯。

1.2 动物 健康Wistar大鼠，雄性，体重(200±10.0)g，由中国医科大学实验动物中心提供。实验前禁食24 h，自由饮水。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制 精密称取柚皮苷对照品2.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成浓度为200 μg/mL的储备液。精密吸取该储备液2.5 mL，用甲醇稀释至25 mL，配成浓度为20 μg/mL的工作溶液，吸取该溶液适量进行一系列稀释，得到系列浓度的对照品溶液和低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3个浓度的质控(QC)溶液。

2.2 空白透析液的配制 准确称量磷酸氢二钾14.11 g，磷酸二氢钾2.59 g，氯化钠1.99 g，以适量超纯水溶解，并补充体积至1 L，得pH 7.4磷酸缓冲液，即空白透析液。

2.3 空白大鼠血浆的制备 取Wistar大鼠5只，眼眶静脉取血，置肝素抗凝离心管中，3 500 r/min离心5 min，分离血浆，混合，备用。

2.4 LC-MS/MS分析条件

2.4.1 液相色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸(25∶75，v/v)；流速：0.4 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.4.2 质谱条件 ESI源，采用正离子检测模式，离子喷射电压(IS)：4 000 V；毛细管温度：350 ℃；鞘气(N2)：40 L/min；辅助气(N2)：10 L/min；扫描方式为选择性离子监测(SRM)；用于定量分析的离子反应分别为柚皮苷：m/z 579→271和橙皮苷 m/z 609→301，碰撞能量分别为30 eV和25 eV。

2.5 样品处理

2.5.1 透析内液血浆样品的预处理 精密吸取透析平衡后的袋内血浆50 μL，置于1.5 mL具塞试管中，加入50 μL内标溶液(1 000 ng/mL)和50 μL甲醇，混匀，然后加入250 μL甲醇，涡旋1 min混合均匀，10 000 r/min离心5 min，取上清10 μL进行LC-MS/MS分析。

2.5.2 透析外液样品的预处理 取透析外液，用孔径0.45 μm的水系过滤器过滤后吸取50 μL，依次加入50 μL内标溶液、50 μL甲醇，涡旋混合均匀，取10 μL进行LC-MS/MS分析。

2.6 分析方法验证考察

2.6.1 标准曲线 取空白血浆或空白透析液50 μL，加入柚皮苷标准品系列溶液50 μL，配制相当于空白血浆或空白透析液中浓度为50、150、500、1 000、2 000和5 000 ng/mL的样品，按“2.5”项下方法操作，建立工作曲线。用加权最小二乘法[8]以柚皮苷的峰面积(y)对其浓度(c)作图，求得直线回归方程。

2.6.2 准确度与精密度 取空白血浆或空白透析液50 μL，按“2.6.1”项下方法操作，配成低、中、高3个浓度(150、1 000和4 000 ng/mL)的QC样品。考察方法的日内和日间精密度(RSD，%)和准确度(RE，%)。

2.6.3 提取回收率 取空白血浆50 μL，按“2.6.1”项下方法操作，配成低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3个QC浓度，每个浓度3个样本，考察方法的提取回收率。

2.6.4 稳定性 取空白血浆50 μL，按“2.6.1”项下方法操作，配成低、中、高(150、1 000、4 000 ng/mL)3个浓度，考察血浆样品处理后室温放置4 h和-20 ℃保存1周的稳定性。

2.7 血浆蛋白结合率测定 本研究采用平衡透析法研究柚皮苷的大鼠血浆蛋白结合率。将透析袋剪成约10 cm左右的小段，用蒸馏水煮沸5 min，再用60 ℃蒸馏水冲洗2 min后在缓冲液中浸泡，4 ℃保存备用。将处理后的透析袋一端折叠，结扎，将1 mL空白血浆加入透析袋内，将透析袋另一端扎紧，将其悬浮于盛有15 mL缓冲液的广口瓶中，膜外缓冲液中样品质量浓度分别为100、600和3 600 ng/mL，将透析袋内外液面调节至同一水平面，并避免透析袋贴于瓶壁。将瓶口密封后，于4 ℃静置48 h至药物扩散平衡。透析结束后，使用10%高氯酸溶液检查透析外液有无蛋白漏出，有漏出者视为作废。平衡结束后，分别吸取袋内、袋外样本，采用建立的LC-MS/MS方法测定其浓度，并使用下列公式计算血浆蛋白结合率：PB ratio(%)=(Cinside-Coutside)/Cinside×100%，其中，PB ratio为血浆蛋白结合率；Cinside为袋内血浆中药物的浓度；Coutside为袋外透析液中药物的浓度。

3 结果

3.1 方法学验证 在本研究条件下，空白血浆、空白透析液不干扰柚皮苷的测定(见图1)。在空白血浆或空白透析液中，柚皮苷在50.0～5 000 ng/mL范围内线性关系良好(r>0.998)，典型回归曲线分别为y=0.001 4+0.028 2 c和y=0.003 2+0.045 4 c，方法的定量下限为50.0 ng/mL。透析内液和透析外液低、中、高3个浓度(150、1 000和4 000 ng/mL)的QC样品连续测定3 d的准确度和精密度良好，日间和日内精密度均在±15%之间，准确度在-7.82～6.45之间。透析袋内血浆中柚皮苷的提取回收率在90.2%～93.5%之间。稳定性考察结果表明血浆样品在室温放置4 h和-20 ℃保存1周稳定。

3.2 透析平衡时间的确定 为了考察透析平衡时间，将处理过的透析袋一端扎紧，吸取1 mL空白血浆加入透析袋内，将透析袋另一端扎紧，使其悬浮于盛有15 mL含药缓冲液(600 ng/mL)的广口瓶中。将瓶口密封后，置于37 ℃水浴中，分别在12、24、36、48和60 h吸取透析袋内外液适量进行LC-MS/MS分析，测定透析袋内外液的浓度，以当日标准曲线计算透析袋内外柚皮苷的质量浓度，以二者比值确定药物从袋内外自由扩散达到平衡的时间。结果显示，48 h时，袋内、外溶液中柚皮苷的质量浓度相等，表明扩散48 h已达到平衡，因此设定平衡透析时间为48 h。

图1 袋内血浆中柚皮苷的典型HPLC-MS/MS色谱图

3.3 血浆蛋白结合率测定 柚皮苷的大鼠血浆蛋白结合率测定结果见表1，低、中、高3个浓度的柚皮苷的血浆蛋白结合率在90.5%～96.3%之间。采用SPSS 17.0统计软件对不同浓度样品的血浆蛋白结合率进行单因素方差分析，结果显示，低、中、高3个浓度之间的血浆蛋白结合率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 柚皮苷大鼠血浆蛋白结合率测定结果

4 讨论

药物血浆蛋白结合是指药物与血浆中的蛋白结合，形成药物-大分子复合物[9]。药物与血浆蛋白之间的结合反应对药物的消除有重要影响，通常情况下，血浆蛋白结合率高的药物入血后分布较慢，消除半衰期较长。本文研究的结果显示，柚皮苷的血浆蛋白结合率较高，约为70%。文献报道[10]，口服给药后柚皮苷的消除半衰期约为5 h，应属于常速消除的药物，与其较高的血浆蛋白结合率所提示的消除时间较长不相吻合，这可能与柚皮苷在肠内细菌作用下发生脱糖基化反应，主要以苷元形式吸收入血有关[11]。

血浆蛋白结合率的研究方法主要有平衡透析法、超过滤法、超速离心法和凝胶过滤法等[12]，而平衡透析法是研究血浆蛋白结合率的经典方法，简单、经济，因此，本实验选择此方法来测定柚皮苷的血浆蛋白结合率。

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Study on plasma protein binding rate of naringin in rats

LI Ji-hong

(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

Objective To study the plasma protein binding rate of naringin in rats.MethodsUnder three different concentrations (100,600 and 3 600 ng/mL),this paper used equilibrium dialysis method to imitate the binding process between naringin and the plasma protein of rats,and determined the concentration of naringin in and out of the dialysis membrane by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.The binding rate was calculated.ResultsUnder the experimental concentrations,the plasma protein binding rates of naringin in rats were 91.5%,90.5% and 96.3% at low,middle and high concentrations,respectively.There was no significant difference among the three concentrations.ConclusionNaringin is highly bound to plasma proteins in rats.

Naringin; Plasma protein binding rate; Rat; Equilibrium dialysis

2014-01-15

辽宁中医药大学附属医院药剂科，沈阳 110032

10.14053/j.cnki.ppcr.201505020