贵州省部分地区阴道毛滴虫与人型支原体共生情况*



贵州省部分地区阴道毛滴虫与人型支原体共生情况*

网络出版时间：2015-03-19网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.1021.028.html

匡贵榕1, 衣凤芸2, 杨宇箭1, 程其会1, 王丽娟1, 吴家红3**

(1.安顺市人民医院 妇产科， 贵州 安顺561000； 2.《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》编辑部， 上海200025； 3.贵阳医学院 寄生虫学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 了解贵州地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生情况。方法： 以贵州部分地区女性阴道毛滴虫病患者阴道后穹隆分泌物中采集的阴道毛滴虫虫株，实验室达到纯培养后，采用Chelex-100的方法提取滴虫基因组DNA，设计人型支原体16S rDNA特异引物，进行聚合酶链式反应(PCR)，琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行分析，观察滴虫细胞内人型支原体共生情况。结果： 从临床共采集到165株虫株中，83株获得纯培养；83株中人型支原体检测结果显示有47株阳性，阳性率为56.6%。结论： 阴道毛滴虫虫株与人型支原体共生情况在我国贵州地区普遍性存在。

[关键词]毛滴虫,阴道； 支原体人型； 16S rDNA； 聚合酶链式反应； 共生

阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)是寄生在人体泌尿生殖系统的原虫，能引起的阴道毛滴虫病；这是世界范围内流行的非病毒性性传播疾病，是引起女性阴道炎的一个重要原因，全球每年约有1.7亿人被感染。人型支原体(Mycoplasmahominis)是一种常见的寄生于人体泌尿道和生殖道的病原体，既往曾认为它是对人类无害的共栖微生物，近年来却发现，人型支原体感染不仅可致阴道炎、宫颈炎等下生殖道的炎症，还可致子宫内膜炎、输卵管炎以及盆腔炎等疾病。国外的研究显示人型支原体能够进入毛滴虫细胞内长期存活并进行细胞内复制，形成稳定的共生关系，这种共生可保护人型支原体免受宿主防御机制和药物治疗等外环境的影响。2009年1月~2012年9月采用聚合酶链式反应(PCR)技术对贵州部分地区的阴道毛滴虫临床分离株内的人型支原体进行检测，初步了解贵州部分地区阴道毛滴虫与人型支原体的共生情况。

1材料与方法

1.1　阴道毛滴虫的来源及培养

阴道毛滴虫采自贵阳市妇产医院、 安顺市地区人民医院和安顺市计生站女性阴道毛滴虫病患者。于无菌条件下，使用消毒棉签取患者阴道后穹窿分泌物置入含抗生素(终浓度：青霉素 200 U/mL,链霉素 200 U/mL)及10%小牛血清的肝浸汤培养基中，保温条件下迅速送至实验室进行培养。 37 ℃培养24 h后，吸取培养管近底部液体10～20 μL，在显微镜下观察是否有滴虫生长，如为阴性，继续培养3代，如果仍为阴性，灭菌后丢弃；如为阳性，48 h后传代，共传代 3次。取1 mL毛滴虫的混悬液接种到Luria-Bertani培养基(LB培养基)，37 ℃振荡培养24 h，若未出现浑浊，且取样镜检未见污染，即证明该样品已达到纯培养，用于后续实验。

1.2　主要试剂和仪器

蛋白胨、L—半胱氨酸盐酸盐和酵母浸出液均购自美国Amresco公司。dNTPs和TaqDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司，琼脂糖购自美国Promega公司，Chelex-100购自美国BIO-RAD公司，其余试剂均为进口或国产分析纯。电泳仪(DYY2C)为北京六一仪器厂产品，凝胶成像分析系统为美国GE公司产品。

1.3　方法

1.3.1DNA提取[4-5]采用chelex-100的方法，将纯化的滴虫培养至对数生长期时，在血细胞计数板上计数滴虫，滴虫浓度达到1×107/mL时，将培养液12 000 r/min离心5 min后收集滴虫虫体到1.5 mL EP管中，加入200 μL 5% Chelex-100 和10 μL的20 g/L蛋白酶K，振荡混匀，55 ℃孵育45 min，沸水浴中8～10 min，冰浴2 min，室温下12 000 r/min离心3 min，上清即为DNA，将提取的DNA经紫外分光光度计检测浓度和纯度后，-20 ℃保存。

1.3.2 人型支原体的16S rRNA基因参照文献设计扩增人型支原体的16S rRNA基因序列的特异性引物，上游引物为5′-CAATGGCTAATGCCGGATACGC-3′，下游引物为5′-GGTACCGTCAGTCCGCAAT-3′。片段大小为334 bp，反应体系为模板DNA 50 ng ，10×PCRbuffer 2.5 μL，MgCl2(2.5 mmol/L) 3 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL，TaqDNA聚合酶1.25 U，上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，总体积25 μL。反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s、35个循环，72 ℃ 5 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，并在成像系统中成像。

2结果

本实验共采集到165株阴道毛滴虫临床分离株，达到纯培养并用于本研究的有83株，达到纯培养的滴虫见图1。对达到纯培养的83株虫株进行人型支原体PCR检测，结果显示共有47株分离株在约为330 bp处扩增出特异性产物(图2)，说明这47株分离株为人型支原体阳性，阳性率为56.6%(47/83)。

图1　光镜下阴道毛滴虫滋养体(40×)Fig.1　Trophozoite of Trichomonas vaginalis

3讨论

M为100 bp DNA标志物，1-23为23个分离株的编号，C为阴性对照图2　PCR检测阴道毛滴虫临床分离株内人型支原体Fig.2　Detection of M. hominis in clinical strains of T.vaginalis by PCR

1975年, Nielsen通过电子显微镜观察到阴道分泌物和体外培养6周的阴道毛滴虫大食物泡内有支原体存在，从形态学上第1次发现阴道毛滴虫与人型支原体的共生关系。 Rappelli等体外感染实验发现只有人型支原体能感染无支原体感染的阴道毛滴虫，而作为泌尿生殖道感染的主要病原体解脲支原体和生殖支原体并不能感染。同时他们还发现感染有人型支原体的阴道毛滴虫可以将支原体传播给阴道上皮细胞，且阴道上皮细胞中的人型支原体也可感染阴道毛滴虫。从而证实了这两种营寄生生活的病原体之间存在共生关系。流行病学调查结果显示,从临床分离到的35株阴道毛滴虫中有33株内有人型支原体，阳性率为94.3%。表明这两种生物的共生是一种普遍现象。本研究对从贵州省部分地区分离到的83株阴道毛滴虫虫株人型支原体感染调查显示有47株检测阳性，阳性率为56.6%，这一结果和Xiao等报道的从中国广州地区分离到的28株阴道毛滴虫检测到14株人型支原体阳性虫株，阳性率50%的结果比较接近，但低于刘晓东等[10]在郑州大学附属医院从30个阴道毛滴虫虫株中检出25株人型支原体阳性(83.33%)，河南地区41株阴道毛滴虫虫株中检测出34株阳性的结果(82.9%)[11]，但却高于四川地区160株检出61株阳性(38.1%)[12]和谢成彬等[13]在四川省妇幼保健院妇科门诊检测38.0%(76/200)的结果。说明人型支原体与阴道毛滴虫的共生具有地域的差别。此外，最新的研究显示人型支原体的共生可上调促炎细胞因子的表达，表明人型支原体的共生可加重阴道毛滴虫对宿主的损害[14]。这就提醒临床医生在发现阴道毛滴虫后有必要进一步做支原体的检测，同时在治疗上也最好联合用药，以提高滴虫性阴道炎的治疗效果。当前，关于两者的共生与阴道毛滴虫产生抗药性是否有关的研究还很少，如能进一步从生理、药理和遗传等多方面了解这两种病原体的关系及其对人体的影响，则意义显得更为重要。

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(2014-12-28收稿，2015-02-20修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑：刘华

Investigation on Symbiosis ofMycoplasmahominisinTrichomonas

vaginalisin Some Areas of Guizhou Province

KUANG Guirong1, YI Fengyun2, YANG Yujian1, CHENG Qihui1, WANG Lijuan1, WU Jiahong3

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,AnshunCitypeople'sHospital,Anshun561000,Guizhou,China;

2.EditorialDepartment,ChineseJournalofParasitologyandParasiticDiseases,Shanghai200025,China;

3.DepartmentofParasitology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the symbiosis of Mycoplasma hominis in Trichomonas vaginalis in Guizhou Province. Methods: The clinical strains of T. vaginalis were collected from the hospitals and family planning service stations in Guiyang city and Anshun city. After pure culture in lab, the genome DNA of T. vaginalis was extracted by Chelex-100, and 16S rDNA fragment of M. hominis was amplified by PCR with the specific primers. Agarose gel electrophoresis analysis was conducted and the symbiosis of M.hominis in T.vaginalis was observed. Results: A total of 165 strains were collected from the hospitals and family planning service stations, and 83 clinical strains attained pure culture, of which 47 strains were detected positively for M. hominis. The positive rate was 56.6%. Conclusions: The symbiosis of M.hominis in T.vaginalis is prevalent in Guizhou province.

[Key words]Trichomonas vaginalis; Mycoplasma hominis; 16S rDNA; polymerase chain reaction; symbiosis

[中图分类号]R382.211

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)03-0249-04

通信作者**E-mail:657490050@qq.com

[基金项目]*贵州省省长 [黔科教办(2005)14号]；安市科合[20]36号；贵阳医学院博士启动基金