膜联蛋白Ⅱ反义寡核苷酸对人膀胱癌BIU-87细胞膜联蛋白Ⅱ表达及细胞侵袭力的影响

陈潇雨，张威，屈颖伟，王锁刚

（1.河南中医学院第一附属医院泌尿外科，河南 郑州 450000；2.郑州大学第三附属医院病理科，河南 郑州 450000）

·论著·

膜联蛋白Ⅱ反义寡核苷酸对人膀胱癌BIU-87细胞膜联蛋白Ⅱ表达及细胞侵袭力的影响

陈潇雨1，张威2，屈颖伟1，王锁刚1

（1.河南中医学院第一附属医院泌尿外科，河南 郑州 450000；2.郑州大学第三附属医院病理科，河南 郑州 450000）

目的探讨膜联蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）反义寡核苷酸（ASODN）对膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡ基因表达及侵袭力的影响。方法设计合成AnnexinⅡASODN，采用脂质体将低、中及高浓度（6、12及18μmol/L）的AnnexinⅡASODNs分别转染BIU-87细胞24、48及72 h，同时设空白对照组（不转染）。采用免疫细胞化学与原位杂交法分别检测各组细胞中AnnexinⅡ蛋白与mRNA的表达；采用MTT法检测细胞增殖情况，计算细胞生长抑制率，采用Boyden chamber侵袭实验检测高浓度转染72 h细胞侵袭力情况。结果与空白对照组相比，各转染组细胞AnnexinⅡ蛋白和mRNA的表达均减弱，且差异均有统计学意义（P<0.05），且AnnexinⅡ蛋白及mRNA的表达随AnnexinⅡASODN浓度的增加及转染时间的延而减弱（P<0.05）；AnnexinⅡASODN转染组细胞生长抑制率明显增加（P<0.05）；细胞穿越Matrigel的细胞数交空白组减少，且差异均有统计学意义（P<0.05）。结论AnnexinⅡASODN可有效抑制膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡ蛋白及mRNA的表达，抑制BIU-87细胞的生长及侵袭力。

膜联蛋白Ⅱ；反义寡核苷酸；BIU-87细胞；侵袭力

膜联蛋白（Annexin）Ⅱ属于膜联蛋白家族，参与信息转导、DNA的合成、细胞骨架活动、细胞迁移及细胞增殖等[1-2]。研究表明，AnnexinⅡ基因的表达失调与多种肿瘤的发生发展密切相关[3-5]，已成为肿瘤治疗的新靶点。作者利用反义寡核苷酸技术转染膀胱癌BIU-87细胞，观察其对细胞AnnexinⅡ基因表达及细胞侵袭力的影响，从而为分子靶向治疗膀胱癌的提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌BIU-87细胞株由北京大学泌尿外科研究所惠赠，体积分数10%胎牛血清的RPM I 1 640培养液购上海克隆生物化学制品有限（北京）公司，Lipofecter脂质体转染试剂购自碧云天生物技术研究所，全硫代修饰Annexin的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）（5'-ACACATCT GGTGACTTCCGCAA-3'）及AnnexinⅡmRNA生物素标记探针（5’-GGCCAATGTGTTCAACCAAGCGG -3’）由北京奥科生物技术有限责任公司合成，兔抗人AnnexinⅡ多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，预杂交液、核固红购自武汉博士德公司，碱性磷酸酶标记链亲和素（alkaline phos phatase strep tavidin，APS）和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/显色原硝基四氯唑蓝（BC IP/NBT）购自美国Promega公司，Matrigel胶购于BD biosciences公司。

1.2 细胞分组培养及转染

复苏后的BIU-87细胞于RPMI 1 640培养液（含体积分数10%胎牛血清，青霉素100 u/L，链霉素100 u/L），37℃、5%二氧化碳CO2孵育箱内培养。实验选用对数生长期细胞，待细胞长满培养瓶后消化、以细胞数8×105/孔接着24孔培养板空培养。用Lipofecter脂质体将6μmol/L（低浓度）、12μmol/L（中浓度）及18μmol/L（高浓度）的AnnexinⅡASODN转染BIU-87细胞24、48及72 h，并设空白对照组（不转染）。

1.3 细胞滴爬片的制备

按实验要求消化、收集24孔板中各组细胞，制成3.0×105个/ml的细胞悬液，取100μL细胞悬液滴到载玻片（经清洗、泡酸及高压消毒）上，放入湿盒，置于细胞培养箱中培养8～9 h，待细胞贴壁后晾干，40 g/L多聚甲醛固定，4℃冰箱保存。

1.4 AnnexinⅡ蛋白的免疫细胞化学法检测

参照PV9000二步法免疫组化试剂盒说明书操作，以PBS代替一抗为阴性对照，以已知AnnexinⅡ阳性表达的肝癌组织切片为阳性对照。AnnexinⅡ蛋白阳性信号定位于细胞质，呈棕黄色。高倍镜下随机选取10个视野，每个视野观察细胞数不少于100个。按阳性细胞百分比及着色深浅进行结果判定[6]。评分标准：①阳性细胞百分比<1%为0分，～25%为1分，～50%为2分，～75%为3分，>75%为4分。②细胞显色为0分，淡黄色为1分棕黄色为2分，棕褐色为3分。上述2种评分结果相乘，以积分值表示AnnexinⅡ蛋白的表达水平。

1.5 AnnexinⅡmRNA的原位杂交法检测

参照原位杂交试剂盒说明书操作，以不含探针的预杂交液孵育的组织切片作阴性对照，用已知AnnexinⅡ阳性表达的肝癌组织作阳性对照。AnnexinⅡ原位杂交阳性信号定位于细胞质，呈蓝紫色。高倍镜下随机选取10个视野，每个视野观察细胞数不少于100个。按阳性细胞百分比及着色深浅进行结果判定[6]。阳性细胞数≤10%、～30%、～70%和>70%分别记为1、2、3和4分。按杂交信号强度分为弱、中和3级，分别记为1、2和3分。上述2种评分结果相乘，以积分值表示AnnexinⅡmRNA的表达水平。

1.6 四唑盐比色试验（MTT法）检测细胞生长抑制率

96孔板收集对数生长期细胞，每空加入20μl MTT溶液和150μl二甲基亚砜后，按实验要求处理细胞并培养至各时间点，酶标仪检测各空光密度（D）值（λ=490 nm），每组设3个复孔，取均值，每组检测10次。细胞生长抑制率=（1–转染组D/对照组D）×100%。

1.7 Boyden chamber侵袭小室实验

于6孔培养板中置放小室，用聚碳酸酯膜将上下室分开，膜上铺设人工基底膜Matrigel 120 g/室（取50μl无血清1 640培养基用来稀释），37℃环境中放置30～60 min，使其形成凝胶状，可以仿制人体内细胞外基质和基底膜环境。再次使用无血清1640培养基冲洗2次。将高浓度转染组转染72 h及相应的对照组细胞悬液稀释成浓度为5×105个/ml的单细胞悬液；每个小室加400μl稀释好的各组单细胞悬液，每组细胞加3个小室；常规条件下培养24 h；取出小室，用棉签小心擦净膜上室面的胶和细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色后，细胞面朝上贴附到载玻片上；显微镜下随机计数5个高倍（400×）视野内的穿膜细胞数，计算平均值。

1.8 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，资料用均数±标准差（x±s）表示；多组均数的比较均用方差分析，方差不齐时可用变量转换来处理；两组组均数的比较用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各种细胞AnnexinⅡ蛋白的表达

不同浓度AnnexinⅡASODN转染组AnnexinⅡ蛋白的表达均低于对照组，且差异均有统计学意义（P<0.05）；不同浓度及不同转染时间AnnexinⅡASODN转染组间两两相比，AnnexinⅡ蛋白表达的差异均有统计学意义（P<0.05），且随浓度的增加、转染时间的延长而降低。见表1、图1。

2.2 各组细胞AnnexinⅡmRNA的表达

不同浓度AnnexinⅡASODN转染组细胞An nexinⅡmRNA的表达均低于对照组（P<0.05），且不同浓度及不同转染时间AnnexinⅡASODN转染组间两两相比，mRNA表达的差异均有统计学意义（P<0.05），且随浓度的增高、时间的增加而减弱。见表2、图2。

2.3 各种细胞生长抑制率的比较

不同浓度AnnexinⅡASODN分别转染细胞24、48及72 h，各组细胞生长抑制率均高于空白对照组（均P<0.05），细胞生长抑制率随转染浓度的增高、转染时间的延长而增高，且不同浓度及不同转染时间各组两两相比，差异均有统计学意义（均P <0.05），见表3。

2.4 Boyden chamber体外侵袭试验

AnnexinⅡASODN组细胞穿越Matrigel的细胞数少于空白对照组，且差异有统计学意义（P<0.05）。见表4、图3。

图1 3种不同浓度AnnexinⅡ转染72 h后，各种细胞AnnexinⅡ蛋白的表达（PV，400×）

图2 3种不同浓度AnnexinⅡ转染72 h后，各组细胞AnnexinⅡmRNA的表达（BCIP/NBT，400×）

图3 Boyden chamber体外侵袭实验

表1 AnnexinⅡASODN对膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡ蛋白的影响（±s）

表1 AnnexinⅡASODN对膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡ蛋白的影响（±s）

组别24 h48 h72 hF值P值低浓度组5.98±0.465.14±0.484.36±0.538.1720.019中浓度组4.75±0.514.12±0.513.22±0.447.4560.024高浓度组空白对照组4.18±0.55 6.87±0.85 3.08±0.45 7.32±0.92 2.75±0.51 7.11±0.76 6.595 0.231 0.031 0.800 F值14.86043.12058.921 P值0.0020.0000.000

表2 AnnexinⅡASODN对膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡmRNA的影响（±s）

表2 AnnexinⅡASODN对膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡmRNA的影响（±s）

组别24 h48 h72 hF值P值低浓度组5.58±0.555.12±0.494.72±0.781.4480.307中浓度组4.86±0.524.07±0.523.88±0.652.5240.160高浓度组空白对照组3.54±0.57 6.69±0.43 2.85±0.43 6.82±0.61 2.45±0.54 6.92±0.86 3.414 0.092 0.102 0.913 F值32.61553.67934.342 P值0.0000.0000.000

表3 各组细胞生长抑制率的比较（n=30±s）

表3 各组细胞生长抑制率的比较（n=30±s）

组别抑制率/%F值P值24h48h72h空白对照组0.80±0.210.19±0.250.20±0.180.120.892低浓度处理组1.65±0.10 22.60±0.59 31.30±4.05 76.77<0.001中浓度处理组7.12±0.22 28.31±3.55 41.66±4.10 78.14<0.001高浓度处理组F值P 21.63±2.78 138.81 <0.001 45.89±3.88 182.02 <0.001 57.00±5.62 152.66 <0.001 49.87<0.001

表4 Boyden chamber体外侵袭试验结果（±s）

表4 Boyden chamber体外侵袭试验结果（±s）

组别穿膜细胞数ASODN组72.26±2.97空白对照组174.91±3.27 t值36.808 P值0.000

3 讨论

目前，治疗膀胱癌的主要方法主要是手术及术后化疗药物灌注，因膀胱癌的复发率高，致使不少患者反复手术，术后患者生活质量往往较差。近年来，对膀胱癌的诊治水平有了很大的提高，但是浅表性膀胱肿瘤在复发率仍然居高不下，特别是晚期膀胱癌的预后依然较差，膀胱癌患者的死亡率呈逐年增加趋势。所以，寻求治疗膀胱癌的新方法是目前研究的热点。

AnnexinⅡ是Annexin家族成员之一，Annexins是一类钙依赖性的磷脂结合蛋白，参与细胞增殖、分泌、纤溶和细胞骨架连接等重要的生物学功能，但其确切的作用机制目前尚不十分明了。多项研究表明[7-9]，AnnexinⅡ在细胞增殖中起重要作用，在多种肿瘤组织中高表达，且其表达与年龄、组织分化、病理分级及淋巴结转移呈正相关。有研究表明，AnnexinⅡ具有促进肿瘤侵袭及转移的作用，可能与其是组织型纤溶酶原激活物、纤溶酶原及细胞粘合素C的受体有关[10]。AnnexinⅡ能够与纤溶酶、纤溶酶原、组织型纤溶酶原激活物、组织蛋白酶B、细胞黏合素C及细胞外基质等相互作用，它们均与肿瘤的发展及转移密切相关。通过AnnexinⅡ使以上多种蛋白酶及其底物在肿瘤细胞表面共区域化（colocalization），因此可降解肿瘤细胞外基质蛋白，导致肿瘤细胞从原发肿瘤脱离，造成迁移、侵犯局部组织或器官[11]。

反义核酸技术是近年来在基因治疗研究中迅速发展起来的一项新技术，通过碱基配对原则在细胞内与特异性靶mRNA序列相结合，以干扰靶mRNA由细胞核向细胞浆转运、促进RNA酶降解靶mRNA以及抑制相应蛋白质的翻译，从而干扰靶基因的表达，甚至完全阻断。本研究采用反应寡核苷酸技术，将AnnexinⅡASODN转染膀胱癌BIU-87细胞，结果表明，AnnexinⅡASODN可明显抑制膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡ基因蛋白及mRNA的表达，且具有浓度及时间依赖性；AnnexinⅡASODN可明显抑制膀胱癌细胞的生长，另外，Boyden chamber实验结果表明，AnnexinⅡASODN可抑制膀胱癌BIU-87细胞的侵袭力，所以，应用反义寡核苷酸技术通过抑制AnnexinⅡ基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的浸润、转移，达到治疗肿瘤的目的成为可能，为临床治疗膀胱癌提供了新思路。

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Effect of AnnexinⅡASODN on the expression of AnnexinⅡgene and invasion of human bladder cancer BIU-87 cell

Xiao-yu CHEN1,Wei ZHANG2,Ying-wei QU1,Suo-gang WANG1
(1.Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450000,P.R.China;2.Department of Pathology,the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450000,P.R.China)

【Objective】To explore the effect of AnnexinⅡASODN on the expression of AnnexinⅡgene and invasion in human bladder cancer BIU-87 cells.【Methods】The oligonucleotide of AnnexinⅡASODN were designed firstly.Three different concentrations of AnnexinⅡASODN(6,12 and 18 μmol/L was used to transfect BIU-87 cells with different time exposure(24,48 and 72 h),and the control group were established accordingly by no transfection.The level of mRNA and protein of AnnexinⅡin the 6 groups were measured by insitu hybridization and immunocytochemistry.MTT method was used to detect the cell prolife ration and Boyden chamber invasion was used to detect t the BIU-87 cell invasion.【Results】Compared with the control groups,there were significant differences in the expressions of AnnexinⅡmRNA and protein of BIU-87 cells among the 3 groups at 24,48,and 72 h(P< 0.05),and increased with the increase of siRNA concentration and time exposure(P<0.05).Compared with the control groups,the growth inhibition rate of BIU-87 cells transfected with AnnexinⅡASODN for different time exposure was higher(P<0.05),and increased with the increase of ASODN concentration and time exposure(P<0.05).Compared with the control group,AnnexinⅡASODN group can inhibit the invasion force of bladder cancer BIU-87 cell, and the differences were statistically significant(P<0.05).【Conclusion】AnnexinⅡASODN could effectively knockdown the expression of AnnexinⅡ,which could significantly inhibit the invasion force of bladder cancer BIU-87 cell.

AnnexinⅡ;ASODN;bladder cancer BIU-87 cells;invasion

1005-8982（2015）34-0010-05

R737.14

A

2015-02-12

王锁刚，E-mail：wangsuogang2005@126.com