丝素蛋白作为非病毒基因传递载体的研究

余艳妮，李明忠

（苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州215123）

基因治疗是将用于治疗的外源性基因运送到靶细胞内，使其适当表达，达到治疗疾病的目的［1］。基因治疗的关键之一是选择合适的传递和表达载体。理想的基因传递载体应具有良好生物相容性和生物可降解性，无细胞毒性、无免疫源性；能包装并压缩DNA形成较小的载体／DNA复合物；能保护DNA不被降解；能高效地将外源性DNA传递到靶细胞内，使目的基因从内涵体逃逸并得到稳定的表达。基因传递载体分为病毒载体和非病毒载体两大类［2］。

1 用于基因传递的病毒载体

病毒的基因组比较简单，易于改造，是一类高效的基因传递载体。用作基因传递载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒相关病毒和腺病毒等。

逆转录病毒在病毒载体中应用最早。用逆转录病毒包装基因后感染细胞的技术已被广泛研究试图用于骨修复、软骨修复、伤口愈合和组织工程血管领域。包装骨形成蛋白-2基因的逆转录病毒转染骨髓基质细胞后，将细胞种植在支架内移植到大鼠的骨缺损部位，在体内可以诱导骨的形成［3-4］。用携带血管衍生生长因子（PDGF-B）和血管内皮细胞生长因子（VEGF121）基因的逆转录病毒感染种植在聚乙醇酸的支架上的真皮成纤维细胞，植入动物的皮肤缺损创面的结果表明，可以加快伤口的愈合速度［5］。但逆转录病毒有可能被整合到靶细胞的基因组，表达其所携带的外源性基因，这存在基因突变致癌的潜在风险。

腺病毒相关病毒（AAV）是一种无包膜的单链DNA缺陷型病毒。在再生医学领域，有将AAV用作组织工程相关的基因的传递载体的报道。将AAV／血管内皮细胞生长因子基因复合物用于治疗小鼠深度烧伤创面［6］、大鼠全层皮缺损创面［7］和糖尿病小鼠的皮肤伤口［8］的研究表明，AAV／血管内皮细胞生长因子基因复合物可以促进创面的血管化和细胞外基质的成熟，加快伤口的愈合。

腺病毒是双链DNA病毒，具有宿主范围广、携带外源性基因的容量大等优点。导入的基因在宿主细胞内是以游离的形式存在，不会整合到宿主细胞的基因组中［9］。腺病毒作为基因传递载体在组织工程领域也被广泛研究。将携带VEGF基因的腺病毒直接混合到移植颗粒脂肪内注射到体内后，可以促进血管的形成，提高移植脂肪的成活率［10］。但病毒类基因载体仍存在免疫原性等潜在风险，所以构建生物安全性高、生物相容性好、转染效率高和靶向特异性强的新型基因传递载体是基因治疗领域的重要课题。

2 用于基因传递的非病毒载体

非病毒基因传递载体的生物安全性隐患小、免疫原性低、操作简单，近年来得到广泛研究。阳离子脂质体是最常见的非病毒基因传递载体，聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）、壳聚糖、明胶等聚合物作为非病毒基因传递载体也备受关注。

带正电荷的阳离子脂质体［11］与带负电荷的质粒DNA能够通过静电相互作用结合，形成脂质体／DNA复合物。阳离子脂质体表面的过剩正电荷为脂质体／DNA复合物被带负电荷的细胞膜吸附提供条件。脂质体本身具有的亲脂性，使脂质体／DNA复合物能够通过细胞的内吞作用或者细胞膜的融合作用进入细胞，复合物在细胞质或者细胞核内释放DNA，实现基因的转录、翻译和表达［12］。阳离子脂质体通常由阳离子脂质和中性辅助磷脂两部分组成。其中，阳离子脂质可以通过静电引力与带负电荷的DNA质粒结合，包被DNA质粒形成复合物；而中性辅助磷脂则可降低阳离子脂质的细胞毒性，并增强阳离子脂质的细胞渗透能力，提高阳离子脂质体的基因转染效率［13-14］。Jeschke等［15］用阳离子脂质体作为胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ）基因的传递载体，用于大鼠的烧伤创面治疗，结果表明大鼠血清和肝脏中的生长因子蛋白浓度有所提高，创面愈合显著加快。在阳离子脂质体中引入胆固醇或其衍生物后，可以提高脂质体／DNA复合物对靶细胞的基因转染效率。例如，在阳离子脂质体中嵌入胆固醇后，由于胆固醇具有亲脂性，可以使阳离子脂质体／DNA复合物更顺利地通过质膜，提高复合物的细胞渗透功能，并稳定脂质双层膜、减轻阳离子成分对细胞的毒性［16-17］。Shigeta等［18］合成的具有较宽pH缓冲能力的胆固醇衍生物与阳离子脂质体共同包被质粒DNA，转染肝细胞的结果表明，该复合物具有类似聚乙烯亚胺作为基因传递载体时的质子海绵效应，能够加速复合物从溶酶体释放，使外源性质粒DNA有效被释放到靶细胞的细胞质内，明显提高基因转染效率。

除阳离子脂质体外，近年将聚赖氨酸（PLL）、聚乙烯亚胺（PEI）等合成的阳离子聚合物以及壳聚糖、明胶等天然聚合物用作基因传递载体的研究也很活跃。Laemmli等［19］在1975年证明PLL有压缩DNA质粒的能力，体外和体内实验都表明其可用于基因传递载体［20-21］。伯胺基的数量影响PLL压缩DNA质粒形成复合物的能力，只有当PLL的分子量大于3kDa时，才能有效地压缩质粒DNA形成稳定的复合物［22］，而高分子量的PLL存在相对较大的细胞毒性。用聚乙二醇修饰PLL后，可以提高PLL／DNA复合物的稳定性，同时降低对细胞的毒性［23］。

聚乙烯亚胺（PEI）是目前研究最广泛的阳离子聚合物基因载体，也是基因传递能力最强的合成聚合物，被认为是合成高分子基因传递载体的金标准［24］。它有线性和支化两种结构形式。支化PEI作为基因传递载体时的最重要特性是具有质子海绵效应，基因转染效率较高。PEI／DNA复合物进入细胞后，在吞噬泡的酸性环境中质子化，正电荷增多，使溶酶体破裂，复合物可被有效释放，这为后续的基因转录和表达提供了良好基础［25-26］。高分子量的PEI虽然转染效率较高，但因带有高密度的正电荷，且不易被降解，在细胞内的积累影响细胞的功能，细胞毒性较大。通过对高分子量PEI进行化学修饰可以降低其细胞毒性［27］，例如用聚乙二醇修饰PEI后，不仅可降低PEI的细胞毒性、明显提高细胞的存活率，而且可提高PEI／DNA复合物的稳定性，与未经修饰的PEI相比，体外的细胞转染效率提高约三倍［28］。

壳聚糖是天然的阳离子高分子，具有细胞毒性低、可被生物降解、免疫原性低等优点。将其用作基因传递载体的研究表明，它可以有效地压缩DNA并保护其不被核酸酶降解［29-30］。壳聚糖的脱乙酰度、分子量以及DNA浓度、pH值等影响壳聚糖与DNA形成的复合物的性能和基因转染效率［31-32］。壳聚糖也存在与其他非病毒基因传递载体相似的两大不足，即细胞转染效率较低和细胞靶向性弱。

明胶也具有细胞毒性低、可被生物降解、免疫原性低等优点。已被证明可以作为基因传递载体［33］。Hosseinkhani等［34］制备阳离子化明胶／骨形成蛋白基因纳米复合物，将复合物装载于胶原海绵支架内体外转染骨髓间充质干细胞，实验表明，阳离子化明胶能够使其携带的骨形成蛋白基因转染骨髓间充质干细胞，并使目的基因表达、促进骨的形成。

无论是合成高分子还是天然高分子，用作基因传递载体时需要进一步解决的问题是如何使其兼具良好的生物降解性、低毒性、高靶向性和高转染效率。

3 丝素蛋白作为基因传递载体的研究

丝素蛋白具有良好的生物相容性，可被生物降解［35］，对生物体无毒性、无刺激性、无明显的免疫原性，且丝素的降解产物对生物体无毒副作用［36-37］，被广泛地用于细胞培养载体和组织工程支架。经基因工程方法改性的丝蛋白具有新的性能。将蜘蛛丝蛋白的基因与聚赖氨酸基因片段重组后，可得到含聚赖氨酸序列的重组蜘蛛丝蛋白［38］。该重组蜘蛛丝蛋白的表面带更多的正电荷，有助于包被、压缩DNA，形成重组蜘蛛丝蛋白／DNA纳米级的复合物。含有30个赖氨酸残基的重组丝蛋白与DNA复合后转染HEK细胞时的转染效率约为14%，而不含聚赖氨酸序列的丝蛋白的转染效率仅为约0.4%。

柞蚕丝素蛋白是最常见的一种野蚕丝素蛋白，其氨基酸序列中含有的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）三肽序列能与哺乳动物细胞表面黏附家族中的整合素特异性结合，有利于其用作基因传递载体时被细胞粘附、吞噬［39］。Ma等［40］利用带负电荷的柞蚕丝素蛋白的良好细胞相容性和可降解性，能够屏蔽PEI多余的正电荷、减小细胞毒性，表面存在细胞特异性粘附序列，可以与血管内皮细胞、成纤维细胞等细胞表面的受体发生特异性相互作用等特点，用柞蚕丝素蛋白和PEI（25kDa）共同作为VEGF165和Ang-1双基因共表达质粒的传递载体，研究了与PEI单独作为传递载体相比，载体的形态、结构、理化性质的变化，及其对细胞毒性、转染效率的影响。柞蚕丝素蛋白的导入，能够提高PEI／DNA复合物的细胞亲和性，更好地避免其被核酸酶降解。用柞蚕丝素／PEI／DNA复合物体外转染小鼠成纤维细胞L929的结果表明，与单纯使用PEI相比，能有效降低细胞毒性、提高转染效率并使目的基因表达。依靠静电相互作用，用柞蚕丝素蛋白与PEI联合包被质粒DNA后转染HEK293和HCT116细胞时，同样能显著降低PEI／DNA复合物的细胞毒性，更高效地使外源性基因转染HEK293 和 HCT116细胞［41］。

由于未经改性的丝素蛋白在生理条件下带有负电荷，与带负电荷的质粒DNA之间存在静电斥力，难以包裹、压缩DNA。化学改性是调节丝素的性能以适应不同应用需求的重要手段。丝素蛋白含有一定量的带极性侧链的氨基酸残基，能够作为化学修饰的潜在反应位点，这为丝素蛋白的化学改性及其用作基因传递载体提供了物质基础［42-43］。扈永培等［44］利用阳离子多胺类物质精胺对柞蚕丝素蛋白进行化学修饰，使改性后的柞蚕丝素蛋白在生理环境下带正电荷，得到阳离子化的柞蚕丝素蛋白，用阳离子化柞蚕丝素包被VEGF165-Ang-1双基因共表达质粒体外转染小鼠成纤维细胞及血管内皮细胞，能明显提高细胞的转染效率和降低对细胞的毒性，为皮肤真皮等含血管组织的微血管网络再生和缺损组织的修复提供了一种新的基因传递载体。Numata等［45］利用基因工程的方法在家蚕丝素链上插入L-赖氨酸和RGD序列，构建新型丝素蛋白用作基因载体。研究结果表明，当该新型丝素-赖氨酸-RGD聚合物与DNA的N／P比大于2／1时，能够有效包装、压缩DNA。转染人宫颈癌细胞（Hela）和人胚肾成纤维细胞（HEK）的结果表明，该新型丝素蛋白用作基因传递载体时，能够有效地被细胞粘附，尤其能够被细胞膜表明存在大量RGD受体的Hela细胞粘附，能够有效地使其携带的目的基因转染靶细胞。

4 结语

丝素蛋白经生物、化学或物理方法改性后得到的阳离子化丝素蛋白具备作为基因传递载体的基本条件。通过对丝素蛋白的修饰、改性技术及其介导基因转染机制的深入研究，有可能为生物医学领域提供一类高效、低毒性的新型基因传递载体。

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