LC-MS/MS测定小鼠肝脏中10种胆汁酸浓度的方法与应用

沈淑娇 张志荣 曾金 陈文文 过林 贺敏 吴雨 蒋健 裘福荣

胆汁酸是胆汁的主要脂质成分，是胆固醇在肝微粒体中的代谢产物［1］。生物体内，胆固醇在细胞色素P450酶(CYP7A1、CYP8B1与CYP27A1等)的催化下合成胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)等初级胆汁酸［2］，初级胆汁酸可在肠道细菌作用下，经过7α-脱羟基生成去氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)等次级胆汁酸。以上均为游离型胆汁酸，可与甘氨酸和牛磺酸结合生成甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)、甘氨去氧胆酸(GDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)等结合型胆汁酸。合成的胆汁酸通过胆道排入肠腔，经肠道重吸收由门静脉进入肝脏，即经肝肠循环实现大部分胆汁酸的循环利用。剩余胆汁酸经粪便排出，在胆汁淤积时，改向从肾脏排出［3］。

胆汁酸在脂肪和脂溶性维生素的吸收中发挥重要的作用，但胆汁酸本身还具有细胞毒性，若胆汁排出受阻，其在肝内大量淤积会导致肝细胞变性和坏死，甚至导致肝纤维化等疾病的发生［4］。因此，了解胆汁酸在生物体内的含量变化对于肝胆疾病的预防与治疗具有重要价值。

目前，已有研究采用LC-MS/MS、HPLC-UV、GCMS 等方法测定动物及人体血浆［5-9］、胆汁［10，11］和尿液［12］中胆汁酸的含量，但对肝脏中胆汁酸的测定报道较少。本研究建立了一种快速灵敏的LC-MS/MS法，同时检测了小鼠肝脏中游离型及结合型胆汁酸的含量，适用于小鼠肝脏胆汁酸的测定。

材料和方法

一、药品及试剂

胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、去氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)、甘氨去氧胆酸(GDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)、2，2，3，4，4-5 氘代石胆酸(D5-LCA)(美国Sigma-Aldrich公司)。

乙腈(TEDIA公司)，为色谱纯;甲醇(TEDIA公司)，为色谱纯;甲酸(上海试验试剂有限公司)，为分析纯;乙酸铵(国药集团化学试剂有限公司)，为分析纯;活性炭，200目(阿拉丁试剂上海有限公司);实验用水为去离子水。

二、仪器

4000 Q-TrapLC-MS/MS系统(美国ABI/SCIEX公司)，LC-20AD液相色谱仪(日本SHIMADZU公司)，IKA-werkeTyp VX2E震荡器(德国IKA公司)，AB135-S型分析天平(瑞士METTLER公司)，Direct-Q3纯水系统(美国Millipore公司)，XHF-D高速分散器内切式匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，Thermo超低温冰箱(美国Thermo公司)。

三、动物

雌性SPF级C57BL/6小鼠，6周龄，体质量20～22 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号:SCXK(沪)2013-0016。

四、方法

(一)色谱条件 色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C18柱(5 μm，150 mm ×4.60 mm);流动相:A 为含0.05%甲酸的4 mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈;流速:1 mL/min;柱温:40℃;自动进样器温度:4℃;进样量:10μL。梯度洗脱程序为:0 min，A∶B=70∶30;1.0 min，A∶B=65∶35;2.0 min，A∶B=65∶35;3.5 min，A∶B=10∶90;8.5 min，A∶B=10∶90;9.0min，A∶B=70∶30;14.0 min，A∶B=70∶30。

(二)质谱条件 质谱采用ESI离子源，负离子条件，多级反应模式(MRM)监测，离子源电压(IS):-3500V;离子源温度(TEM):500℃;气帘气(CUR):15Psi;气体1(GS1):60Psi;气体2(GS2):60Psi;10种胆汁酸及内标优化后的质谱参数见表1。

表1 胆汁酸质谱参数

(三)标准溶液配制 精密称量各标准品，用甲醇溶解成浓度为1 mg/mL的储备液，将各标准品储备液以不同比例混合制备混合标准品溶液，再用乙腈依次稀释配制7个浓度的溶液及3个浓度的质控(低、中、高)溶液，其中TCA、TDCA、TCDCA、CA的浓度为100 ng/mL ～15 μg/mL，质控(低、中、高)为250 ng/mL、1.5 μg/mL、12 μg/mL，LCA、DCA、CDCA、GCA、GDCA、GCDCA的浓度为20 ng/mL～3μg/mL，质控(低、中、高)为50 ng/mL、300 ng/mL、2.4 μg/mL。内标浓度为 1.5 μg/mL。

(四)肝匀浆样品处理 精密称取50 mg肝组织，加5倍去离子水(250μL)进行匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清50μL置1.5 mL离心管中，精密加入内标溶液 5μL，乙腈 100μL，涡旋 5 min混匀，10 000 r/min离心两次(每次10 min)，吸取80μL至进样瓶中供LC-MS/MS分析。

空白肝匀浆处理:上清肝匀浆加活性炭(100 mg/mL)［13，14］，振摇 1 h 以吸附内源性胆汁酸，10 000 r/min离心10 min去除活性炭备用。

结 果

一、方法学确证

(一)专属性 小鼠空白肝匀浆、小鼠空白肝匀浆添加胆汁酸标准品和内标对照品及受试小鼠的肝匀浆样品的色谱图分别见图1～3。

图1 空白肝匀浆LC-MS/MS图

图2 加入标准品(高浓度)和内标的肝匀浆LC-MS/MS图

(二)标准曲线及最低定量下限(LLOQ) 精密量取“2.3”项下制得的不同浓度的混合标准溶液，加入到50uL空白肝匀浆中，配制成TCA、TDCA、TCDCA、CA 浓度为10、25、75、150、375、750、1500 ng/mL，LCA、DCA、CDCA、GCA、GDCA、GCDCA 浓度为 2、5、15、30、75、150、300 ng/mL 的系列肝匀浆样品，按照“2.4”项下方法操作，并进样分析。分别记录各成分峰面积(AS)和内标峰面积(AIS)，以峰面积(AS)与内标峰面积(AIS)的比值Y对各成分浓度C作加权线性回归计算(权重系数为1/C2)，结果表明各成分在范围内线性良好，本方法的最低定量下限(LLOQ)为0.5～10 ng/mL(见表2)。

(三)精密度与准确度 按照配制标准曲线的方法配制 TCA、TDCA、TCDCA、CA 浓度为 25、150、1 200 ng/mL，LCA、DCA、CDCA、GCA、GDCA、GCDCA浓度为5、30、240 ng/mL的肝匀浆样品，每批每个浓度平行配制5份样品及一条标准曲线，按照“2.4”项下方法处理，并进样分析。由标准曲线计算相应浓度，共进行3批试验，计算各组分批内及批间精密度以及准确度。结果均符合要求(见表3)。

(四)提取回收率 取空白肝匀浆，按照配制标准曲线的方法配制 TCA、TDCA、TCDCA、CA浓度为25、150、1 200 ng/mL，LCA、DCA、CDCA、GCA、GDCA、GCDCA浓度为5、30、240 ng/mL的肝匀浆样品，每个浓度平行配制5份，按照“2.4”项下方法处理，并进样分析;分别记录各成分峰面积AS1。另取空白肝匀浆，按照“2.4”项下方法处理后，于上清液中精密加入与前一步等量的混合标准品溶液，每个浓度平行配制5份，混匀离心后进样分析;分别记录各成分峰面积并计算均值AS2。以AS1/AS2×100%计算回收率，回收率均符合要求(见表3)。

表2 胆汁酸的线性范围、线性回归方程、相关系数及最低定量下限

表3 小鼠肝匀浆中各胆汁酸的精密度、准确度及提取回收率

(五)基质效应 取空白肝匀浆，按“2.4”项下方法处理后，取上清液150μL于1.5mL离心管中，分别加入低、中、高混合标准品溶液5μL，各制备5份，混匀，10 000 r/min离心两次(每次10 min)，取上清液，进样10μL分析;分别记录各组分的色谱峰面积A1。取低、中、高混合标准品溶液5μL，加入乙腈50μL，各制备 3份，混匀，10 000 r/min离心两次(每次10 min)，取上清液，进样10μL分析;分别记录各组分的色谱峰面积A2，计算均值。以A1/A2×100%计算准确度，准确度均值在85～115%，说明无基质效应。

(六)稳定性 低、中、高浓度混合标准品储备液－20℃保存2个月、肝匀浆样品室温放置4 h、处理后冷藏放置24 h、－20℃反复冻融3次均稳定。

二、应用

应用所建立的方法，测定了6只小鼠肝匀浆中各种胆汁酸的浓度，见图4。从测定结果可见，正常C57BL/6小鼠肝中的胆汁酸以牛磺酸结合型(TCA、TCDCA、TDCA)及游离型CA为主，甘氨酸结合型及其他游离型浓度较低，GCDCA在线性范围内检测不到。

图4 6只小鼠肝匀浆中各胆汁酸的平均浓度(ng/g)

讨 论

胆汁酸的理化特性差异较大，且存在多对同分异构体，如鹅去氧胆酸(CDCA)与去氧胆酸(DCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)与甘氨去氧胆酸(GDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)与牛磺去氧胆酸(TDCA)，短时间内很难达到有效的分离。本研究发现在流动相水相中添加甲酸和乙酸铵后，分离效果及灵敏度均较理想，但酸度过高会抑制胆汁酸的离子化。经考察，以4 mmol/L乙酸铵和0.05%的甲酸效果最理想。

胆汁酸属于机体的内源性物质，无法直接获取空白基质进行方法学考察。已有的大部分研究报道［5-8］大都采用扣除本底的方法来消除干扰，结果显示个体差异均较大，存在一定的误差，影响实验结果。国外报道采用活性炭吸附，有效地去除了内源性胆汁酸，减少了对检测结果的影响［13，14］。本研究参考此方法并结合实际试验进行改进，采用150 mg/mL的用量与1 h的振摇吸附时间，经质谱检测可除尽内源性胆汁酸。

肝匀浆样品处理选用乙腈沉淀蛋白法，只需少量样品，方法较液液萃取和固相萃取［7，14，15］简单快速。且相对甲醇沉淀来说，乙腈用量更少，沉淀效果更好。本方法选用同位素内标(D5-LCA)，因其结构与待测胆汁酸相近，质谱液相条件也基本一致，故实验结果更为准确可靠。10种胆汁酸的灵敏度(LLOQ，S/N=5)可达0.5-10 ng/mL，基本满足实验及临床检测需求，优于国内外的大部分报道，与国外的0.2-0.5 ng/mL(LOD，S/N=3)接近［16］。实际应用中，由于样品中TCA浓度超过了检测范围，故单独对其进行了稀释后测定，稀释精密度准确度经考察均符合要求。所建立的小鼠肝脏内10种胆汁酸的检测方法灵敏、快速、简便，线性良好，精密度、准确度、提取回收率等均符合要求，满足检测需要。

本研究中检测的10种成分涵盖了胆汁酸在体内的合成过程(初级、次级)及存在形式(游离型、结合型)，具有代表性，且检测时间仅为14 min，与已有的研究报道［13］比较具有一定优势。从检测结果可以看出，小鼠肝脏游离型胆汁酸中初级胆汁酸CA、CDCA的浓度分别是其次级胆汁酸DCA、LCA的16倍、4.5倍，这与次级胆汁酸的生成过程相符合［3］，且CA是CDCA的16倍;结合型胆汁酸中牛磺酸结合(T-)约为甘氨酸结合(G-)的380倍;游离型和结合型胆汁酸中均以母体CA为主，其中TCA浓度最高，为CA的12倍，GCA的357倍。

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(本文编辑:赖荣陶)