超声波-微波协同提取决明子大黄酚的工艺优化

王 蓉， 邹时英， 付大友， 张 洪, 李艳清

(四川理工学院分析测试中心， 四川 自贡 643000)



超声波-微波协同提取决明子大黄酚的工艺优化

王 蓉， 邹时英， 付大友， 张 洪, 李艳清

(四川理工学院分析测试中心， 四川 自贡 643000)

为充分利用决明子资源,在超声波功率内置为50 W的仪器条件下，采用单因素试验和正交试验考察了提取时间、微波功率、乙醇体积分数、料液比对决明子中大黄酚提取率的影响。结果表明：提取大黄酚的最佳条件为 60%乙醇作提取溶剂，微波功率60 W，提取时间40 min，料液比1∶15(g/g)。在该条件下，决明子大黄酚提取率达2.4%。

决明子； 大黄酚； 超声波-微波协同； 提取工艺； 优化

决明子为豆科植物决明或小决明的成熟干燥种子，具有清肝明目，润肠通便之功效[1]，是国家卫生部公布的69 种药食同源的物质之一。国内外学者的大量研究发现，决明子富含蒽醌类化学物质[2]，大黄酚为其中一种。研究表明，大黄酚具有止咳、抗菌、止血作用[3-6]，并能促进肠管蠕动、神经兴奋、肌肉麻痹[7-8]和明显的抗衰老作用[9]。因此，研究决明子中大黄酚的提取极具应用价值。目前大黄酚的提取方法主要有回流提取[10]，超临界CO2提取[11]、微波辅助提取[12]等。这些方法各具优点，但也存在一些不足。如回流提取法耗时较长，且不利于对热不稳定物质的提取。超临界提取设备相对昂贵。密闭式微波辅助提取对提取罐材料强度和密封性要求很高，样品处理量小，安全性差。近年来未见将超声波和开放式微波相结合用于大黄酚提取的报道。笔者以决明子为原料，探讨并优化超声波-微波协同提取大黄酚的工艺条件，旨在为决明子的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 药材、仪器与试剂

药材：决明子(炒)，购于四川德仁堂中药饮片有限公司自贡同盛大药房，洗净晾干，粉碎成粗粉，过40目筛，备用。大黄酚标准品(中国药品生物制品鉴定所)。

仪器：CW-2000型超声波-微波协同萃取仪(新拓微波溶样测试技术有限公司)，AR1140型电子分析天平(奥豪斯国际上海有限公司)，MJ-176NR型多功能粉碎机(松下电器产业株式会社)，RE-2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Agilent 1100 LC液相色谱仪(美国Agilent公司)，UPK-I-20T优普纯水制造系统(四川成都超纯科技有限公司)。

试剂：甲醇为色谱纯，其余试剂为国产分析纯，试验用水均为超纯水，由优普纯水制造系统制备。

1.2 决明子大黄酚的制备

由于超声波频率(40KHz)、微波频率(2 450 MHz)固定，且萃取仪将超声波功率内置为50 W，并且溶液温度不可调。因此，根据仪器条件，主要选择提取剂乙醇的体积分数，微波功率，提取时间和料液比四个影响因素进行考查。

1.3 不同因素的考察

1.3.1 乙醇浓度 准确称取1.000 g决明子粗粉8份，固定料液比为1∶5(g/g)，提取时间30 min，微波功率60 W，考察乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%和80%的提取率。

1.3.2 微波功率 准确称取1.000 g决明子粗粉5份，固定料液比1∶5(g/g)，提取时间30 min，提取剂为60%乙醇，考察微波功率分别为50 W、60 W、70 W、80 W和90 W的提取率。

1.3.3 提取时间 准确称取1.000 g决明子粗粉5份，在料液比1∶5(g/g)，提取剂为60%乙醇，微波功率60 W时，考察提取时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min时的提取率。

1.3.4 料液比 准确称取1.000 g决明子粗粉5份，提取剂为60%乙醇，提取时间30 min，微波功率60 W时，考察料液比(g/g)分别为1∶3、 1∶6、 1∶9、 1∶12、 1∶15、 1∶18、 1∶21的提取率。

1.4 决明子大黄酚提取的正交试验设计

在单因素试验基础上，以大黄酚含量为考察指标，选择提取剂乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取功率(D)4个主要影响因素，每个因素选取3个水平，即选用L9(34)正交试验进行试验筛选最佳提取工艺，其因素水平见表1。

表1 超声-微波协同提取决明子大黄酚的正交试验因素及水平

1.5 大黄酚定性定量检测

1.5.1 薄层层析 分别取供试品溶液和大黄酚储备溶液2 μL于同一硅胶H薄层板上， 以石油醚(30～60℃)-丙酮(2∶1)为展开剂，按照文献[1]进行薄层层析。若供试品在与对照品相对应的位置上，显示有相同斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为粉红色则为大黄酚。

1.5.2 色谱条件 色谱柱为LichrospherC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相: 甲醇：0.1%磷酸(体积比85∶15)；流速1.00 mL/min，检测器DAD检测器，检测波长为254 nm，柱温为30.0℃，进样量为20 μL，见图1。

图1 大黄酚供试品(A) 和大黄酚对照品(B)的HPLC谱图

Fig.1 HPLC chromatogram of the test solution(A) and the reference solution of chrysophanol(B)

1.5.3 大黄酚标准溶液配制 准确称取5.0 mg大黄酚标准品，无水甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，得1.0 mg/mL的大黄酚标准贮备液。使用时稀释成所需浓度。

1.5.4 供试品溶液的制备 准确称取一定量决明子粗粉于一体化反应器中，按料液比1∶15(g/g)加入60%的乙醇，提取时间40 min，提取功率60 W，置于超声波-微波协同萃取仪中，将超声波设置为开，在选定的微波功率下提取一定时间。提取液离心分离，滤液在45℃温度下减压浓缩至干。残渣用甲醇于水浴温度下溶解，并趁热过滤。将滤液定容为100 mL，再蒸干，加稀盐酸120 mL，置于水浴中加热水解1 h，立即冷却，用三氯甲烷振摇4次，每次120 mL，合并三氯甲烷溶液，回收溶剂至干。残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液使溶解，转移至100 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过，即为供试品溶液，待测。

1.5.5 大黄酚标准曲线绘制 分取不同量的大黄酚储备液，稀释配制成6个不同质量浓度的大黄酚标准工作溶液。按1.2.2色谱条件进样，记录色谱图，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程y=59.568x+3.225 (r=0.999 6 )，线性范围：0～30 mg/L。

1.5.6 大黄酚含量测定 取适量供试品溶液经0.45 μm孔径的微孔滤膜过滤后，按照1.5.2的色谱条件进行HPLC分析，对比供试品和标准品的保留时间和紫外吸收曲线定性，确定出峰物质。根据标准工作曲线计算供试品浓度：

2 结果与分析

2.1 不同因素对大黄酚提取率的影响

由图2可知，在不同乙醇浓度、提取时间、微波功率及料液比下大黄酚的提取含量。

1) 乙醇浓度。在乙醇浓度小于60%时，随着乙醇浓度的增大，大黄酚得率呈上升趋势，这可能是由于大黄酚在水中溶解度小于在乙醇中的溶解度。当浓度为60%时，提取效果最好；随着乙醇浓度的进一步增大，提取效果反而略有下降。因此，乙醇浓度选择50%、60%和70% 3个水平考察。

图2 不同乙醇浓度、提取时间、微波功率及料液比下大黄酚的提取率

Fig.2 Chrysophanol yield under different alcohol concentration, extraction time, microwave power and solid-liquid ratio

2) 提取时间。随提取时间的增加，大黄酚提取率呈上升趋势。这是由于决明子细胞内外大黄酚浓度差是超声-微波协同提取的主要动力。在提取初期，细胞内外大黄酚浓度差大，因此提取速率快，大黄酚提取率增加明显；随着时间的延长，提取剂中大黄酚浓度逐渐增大，与细胞内浓度差逐渐变小，导致提取动力变小，因此提取速率减慢，大黄酚提取率增加不明显，直至推动力为零，有效成分不再溶出；而且随着提取时间的进一步延长，植物组织中大量细胞破裂,导致细胞内大量不溶物及较多树脂、粘液质等混入提取液中，使提取液中杂质增多，粘度增大。这些杂质不但会影响有效成分的溶出,增大传质阻力，而且对提取液的后续处理也极为不利。因此，当有效成分溶出较大时，延长时间对提取不利。故提取时间选择20 min、30 min、40 min 3个水平考察。

3) 微波功率。随微波功率的增大，大黄酚提取率总体呈上升趋势。但超过60 W后，提取率的增加并不明显。这是因为随着微波功率的增大，溶液加热程度也随之增大，有利于大黄酚在乙醇中的溶解，使得提取率增加。但微波功率继续增大，微波的温升作用更加明显，这除了有利于大黄酚的溶出之外，还可能会导致乙醇和大黄酚的挥发损失，从而使大黄酚提取率增加不明显。并且功率超过90 W还会使提取液暴沸，导致萃取过程不易控制，故微波功率选择50 W和60 W、70 W 3个水平考察。

表2 超声-微波协同提取决明子大黄酚正交试验各处理的提取率

Table 2 Extraction efficiency of different treatment for extracting chrysophanol fromC.semenby ultrasonic wave- microwave collaborative method

处理Treatment乙醇浓度/%Ethanolconcentration料液比/(g/g)Material-liquidratio微波功率/WMicrowavepower提取时间/minExtractiontime大黄酚提取量/%Chrysophanolyield11(50)1(9∶1)1(60)1(20)1.1594212(12∶1)2(70))2(30)0.8370313(15∶1)3(80)3(40)1.496042(60)1231.8186522311.3672623122.048073(70)1321.2208832131.8556933211.2804

表3 超声-微波协同提取决明子大黄酚正交试验各因素水平的提取率均值与极差

4) 料液比。在决明子与乙醇的料液比较小时，随着料液比的增加，大黄酚提取率呈上升趋势，决明子与乙醇的料液比达1∶9(g/g)后，大黄酚提取率随料液比的增加不再明显。故从节约溶剂降低成本的角度考虑， 选择料液比1∶9、 1∶12和1∶15(g/g)的3个水平考察。

2.2 超声-微波协同提取决明子大黄酚正交试验各处理的提取率

对决超声-微波协同提取决明子大黄酚的正交试验结果(表2)进行极差分析(表3)可知，4个因素对提取率的影响依次为乙醇体积分数>提取时间>微波功率>料液比。通过k值可以看出，从决明子中提取大黄酚的最佳条件是A2B3C1D3，即60%的乙醇，提取时间40 min，提取功率60 W，料液比1∶15(g/g)。在该条件下，进行6次验证试验，其大黄酚平均提取率为2.4 mg/g，RSD为4.8%。提取率高于以上单因素和正交试验的结果，说明优化方案有效提高了大黄酚的提取率，此工艺稳定性可行。

3 结论

超声-微波协同萃取法将超声波和微波能有机地结合起来，充分利用超声波的空化作用和微波的高能作用，将超声波振动能和通过波导管引出的微波能共同作用于决明子，能有效提高决明子中大黄酚的提取率。试验通过单因素和正交试验优化超声波-微波协同萃取决明子中大黄酚的最佳工艺条件。结果表明，在超声波功率内置为50 W的仪器条件下，影响超声波-微波协同萃取决明子中大黄酚提取率的因素依次为乙醇浓度>提取时间>提取功率>料液比。优化的最佳提取工艺为乙醇浓度60%，提取时间40 min，微波功率60 w，料液比为1∶15(g/g)。采用此优化工艺，大黄酚提取率可达2.4%。该方法具有步骤简单、提取时间快，提取效果好的优点，因而具有良好的应用前景。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S]．北京:化学工业出版社，2010:152．

[2] 郝延军, 桑育黎, 赵余庆.决明子的研究进展[J].中草药，2001,32(9):858-859.

[3] 张济群.降脂祛痰片中大黄酚含量测定[J].中国实验方剂学杂志，1999,5(5)：24-25.

[4] 任红敏,王树桐,胡同乐，等.大黄酚对黄瓜白粉病菌的抑制作用研究[J].植物病理学报，2008，38(5)：526-531.

[5] Wube A A, Bucar F, Asres K, et al. Antimalarial compounds from Kniphofia foliosa roots[J]. Phytotherapy Research, 2005, 19(6): 472-476..

[6] 朱有光.中药大黄止血作用的研究进展[J].临床和实验医学杂志，2008,7(1):138-139.

[7] Zhang W, Ye M, Zhan J, et al. Microbial glycosylation of four free anthraquinones by Absidia coerulea[J]. Biotechnology letters, 2004, 26(2): 127-131.

[8] 李 锋,王胜春,王 新,等.大黄泻下效应的药理学新解释[J].中国中药杂志，2008，33(4)：481-483.

[9] 李淑娟,李春更,侯 勇,等.大黄酚抗衰老作用研究进展[J].河北地方学院学报:医学版，2009，26(1)：69-71.

[10] 贾振宝,丁霄霖.决明子中蒽醌化合物的提取工艺研究[J].食品与机械，2006，22(3)：41-43.

[11] 未作君,林 立, 倪晋仁.超临界CO2萃取大黄总蒽醌工艺研究[J].化学工程，2006，34(8)：63-66.

[12] 靳丹虹,梁芳慧,李敬筠，等.微波辅助提取-HPLC测定决明子中的5中蒽醌类化合物[J].分子科学学报，2007,23(6):429-433.

(责任编辑： 孙小岚)

Optimization of Ultrasonic Wave- Microwave Collaborative Extraction ofChrysophanol fromCassiaesemen

WANG Rong， ZOU Shiying， FU Dayou, ZHANG Hong, LI Yanqing

(AnalysisandTestingCenter,SichuanUniversityofScienceandEngineering,Zigong,Sichuan643000,China)

In order to make full use ofC.semenresource, the extraction technology of chrysophanol fromC.semenwas optimized by ultrasonic wave-microwave collaborative method. The effects of concentration of extracting agent, extraction time, microwave power, solid-liquid ratio were studied by single factor and L9(34) orthogonal tests. Results: When the ultrasonic wave power is fixed 50W, the optimal extraction conditions are as follows: 60% alcohol, extraction time 40 min, microwave power 60W and solid-liquid ratio 1∶15 g/g. Conclusion: The extraction yield was 2.4% under the optimal conditions.

Cassiasemen; chrysophanol; ultrasonic wave-microwave collaborative extraction; extraction process; optimization

2014-10-26； 2015-06-26修回

四川省教育厅重点项目(12ZA265)；四川理工学院科研基金项目(2011KY08)

王 蓉(1979-)，女，副教授，从事中药活性成分提取的研究、仪器分析的教学与科研工作。E-mail:zgrtvu2008@163.com

1001-3601(2015)07-0388-0164-04

S567

A