IKK16对人胶质母细胞瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

黄明火

（湖北省黄冈市中心医院神经外科，湖北黄冈438000）

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤［1］，在中国胶质瘤的发病率较高［2］，目前临床上对于胶质瘤的治疗主要手段是采取以手术为主辅放化疗的综合性治疗［3-5］，由于现有化疗药物对人脑胶质瘤细胞缺乏特异性的杀伤性，因此研究新型的、特异性更高的化疗药物对于脑胶质瘤的治疗具有重要意义，以往研究证实核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）在胶质瘤的发生、侵袭和放化疗产生的耐药性中发挥重要的作用［6］，NF-κB活性主要靠 蛋白激酶（IκB kinase，IKK）的调节，IKK16是一种新型的IKK 特异性抑制剂［7］，本文通过探讨IKK16对人胶质母细胞瘤U87细胞增殖和凋亡的影响，以期为临床上胶质瘤的治疗寻找新的治疗药物。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人胶质母细胞瘤U87细胞由中科院上海细胞所提供。试剂：DMEM 培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司，细胞总蛋白（P0013）、核蛋白与浆蛋白提取试剂（P0028）和ECL发光液（P0018）购自碧云天生物技术公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗鼠IgG 二抗（sc-2020）、Bcl-2、组蛋白H3、CyclinD1、Caspase-3（sc-7148）、p65（sc-109）和H3（sc-8654），β-肌动蛋白（β-actin，sc-7210）的一抗均购自美国Santa Cruz公司，二苯基溴化四氮唑蓝（MTT，M2128）购自美国Sigma公司，IKK16（2639）购自Tocris bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 人胶质母细胞瘤U87细胞的培养 人胶质母细胞瘤U87细胞复苏后接种于培养瓶中，培养基为含10%胎牛血清的DMEM 培养液，置于37 ℃、5%CO2的孵箱中培养，2～3d传代1次，取处于对数生长期的细胞进行药物干预实验。

1.2.2 药物处理及分组 按每孔100μL 1×104的密度接种至96孔板中，每组19个副孔，另加100μL 的培养液，实验分为4组：空白组，对照组［1%二甲基亚砜（DMSO）］，IKK16低剂量组（70nmol／L IKK16）组，IKK16 高 剂 量 组（200nmol／L IKK16），IKK16处理组的DMSO 终浓度均控制在1%。

1.2.3 MTT 比色法检测细胞增殖 将加药后的培养板置入细胞培养箱中，于37 ℃、5%CO2条件下继续培养分别培养至24、48、72h，终止培养前4h各孔加入20μL MTT 溶液，终止培养时吸尽各孔内上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值（A），结果取6个副孔的均值，并计算细胞增殖抑制率＝（对照组A值-干预组A值）／对照组A值×100%。

1.2.4 Western blot检测p65、CyclinD1、Bcl-2和Caspse-3的表达 收集IKK16处理48h后的胶质瘤细胞与对照组细胞PBS洗2遍后，3 000r／min离心15min，使用核蛋白提取试剂提取核蛋白，用于p65的检测；使用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白用于CyclinD1、Caspase-3和Bcl-2的表达检测，二喳淋甲酸（BCA）检测法蛋白定量，取蛋白样品35μg，电泳后转膜，5%的脱脂奶粉封闭1h，H3、p65、CyclinD1、β-actin、Caspase-3和Bcl-2抗体用5%牛奶稀释（1∶200），4 ℃过夜，TBST 洗膜，5%的牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗，洗膜，按照ECL说明书，1∶1配置发光工作液，凝胶成像仪成像，Image J软件进行灰度分析。

1.3 统计学处理 用SPSS13.0 软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IKK16抑制细胞的增殖 空白组与对照组U87细胞增值率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），因此在下面的机制研究中，仅在对照组、IKK16低剂量组和IKK16高剂量组3组之间进行比较。与对照组比较，IKK16低、高剂量组在48h可以显著降低U87细胞的增殖（P＜0.05）；在72h，IKK16低、高剂量组抑制U87细胞的增殖作用更明显，且呈剂量依赖性，浓度越高抑制作用越明显（P＜0.05），见表1。

表1 各组不同时间点对Eca109细胞的增殖抑制率 比较（±s，n＝10，%）

表1 各组不同时间点对Eca109细胞的增殖抑制率 比较（±s，n＝10，%）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与IKK16低剂量组比较。

时间 对照组 IKK16低剂量组 IKK16高剂量组24h 0.01±0.03 19.5±2.38a 48.2±3.58 ab 48h 0.09±0.04 34.9±2.69a 63.3±4.19ab 72h 0.13±0.09 46.7±3.04a 91.5±6.55 ab

2.2 IKK16对细胞核内p65表达的影响 IKK16干预后48 h，与对照组和IKK16低剂量组比较，IKK16高剂量组明显抑制细胞核p65的表达（P＜0.05），见图1、表2。

2.3 IKK16对凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2表达的影响 IKK16 干预后48h，与对照组和IKK16 低剂量组比较，IKK16高剂量组可以显著抑制CyclinD1的表达（P＜0.05），明显增加Caspase-3的表达（P＜0.05）。与对照组比较，IKK16高、低剂量组均可抑制Bcl-2的表达（P＜0.05）；但IKK16高、低剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、图2。

图1 Western blot法检测IKK16对p65的影响

表2 各组p65、CyclinD1、Caspase-3等灰度分析 比较（±s，n＝10，蛋白／内参）

表2 各组p65、CyclinD1、Caspase-3等灰度分析 比较（±s，n＝10，蛋白／内参）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与IKK16低剂量组比较。

项目 对照组 IKK16低剂量组 IKK16高剂量组p65 0.92±0.15 0.73±0.11a 0.09±0.02 ab CyclinD1 2.32±0.58 1.03±0.15a 0.34±0.13ab Caspase-3 0.12±0.09 0.49±0.07a 0.98±0.25ab Bcl-2 0.59±0.09 0.21±0.71a 0.19±0.83 a

图2 IKK16对CyclinD1、Caspase-3 和Bcl-2表达的影响

3 讨 论

近年来，尽管治疗胶质瘤的新手段、新技术不断出现，但是胶质瘤患者的预后仍然较差，究其原因主要在于胶质瘤具有高度的侵袭性，术中难以完全切除肿瘤组织，术后残存浸润的肿瘤细胞极易产生复发，有研究表明，采用单纯手术治疗的患者平均生存时间约为18周，手术联合放疗中位生存时间约为37周，采用手术联合放化疗三联方案治疗的患者平均生存时间可以达到术后52周左右［8］，因此术后联合放化疗、生物免疫等综合性治疗已经成为临床上胶质瘤治疗的专家共识［9］。然而，由于目前放化疗对胶质瘤细胞缺少特异性，在杀灭肿瘤细胞的同时往往会造成正常脑组织的损害，引发脑水肿和颅内高压，给患者带来额外的痛苦，严重影响患者的生活质量。因此，研发新型有效、不良反应少的化疗药已经成为胶质瘤治疗的重点和热点，大量研究表明NF-κB 信号通路很有潜力成为一种新型化疗药物的作用靶点。NF-κB 最初是作为B 淋巴细胞中κB轻链基因表达的调控因子而被发现的，随着研究的不断深入，大量研究证实NF-κB 在多种肿瘤组织中表达增加，在中枢神经系统胶质瘤中，与正常脑组织相比，NF-κB在所有的星形细胞瘤和高级别星形细胞瘤系组织中表达量均异常增加［10］，选择性降低NF-κB的活性可以显著抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭，此外下调NF-κB的活性可以增强胶质瘤细胞对于化疗和放疗的敏感性，提高治疗的有效性［11］，一项临床前期的动物体内实验发现，柳氮磺砒啶可以通过抑制NF-κB 的活性显著降低裸鼠体内U87细胞的生长和增殖，因此，靶向性抑制NF-κB的活性对于胶质瘤细胞的治疗具有重要的临床应用前景。

NF-κB主要包括2 个亚单位：Rel（cRel）和p65（RelA），这二者组成的异源二聚体在绝大多数细胞中以非活性形式存在于细胞质中［12］；当细胞受细胞外信号刺激后，IKK 接受上游调节蛋白的磷酸化，并被激活，激活后的IKK 使IκB 磷酸化，并发生泛素化降解，失去IκB阻碍作用的p65迅速移位到细胞核，与特异性NF-κB 位点结合，诱导相关基因转录。IKK 是NF-κB激活的关键性酶，主要由一个大的蛋白激酶复合体组成，其中包括具有催化活性的IKKα、IKKβ和一个有调节功能的IKKγ3个亚单位。IKKα通过使IκBα上Ser32和Ser36磷酸化，而IKKβ不仅可以使IκBα上Ser32 和Ser36 磷酸化，还能使IκBβ上的Ser19、Ser23磷酸化。有研究证实NF-κB在肿瘤中的作用主要是抑制凋亡蛋白的表达，以及促进抗凋亡蛋白的表达，此外，NF-κB 还可以促进转移相关因子MMP9 的转录，增强肿瘤细胞的侵袭性［13］。在胶质瘤细胞中，CyclinD1蛋白是受NF-κB调节的一种重要的细胞周期蛋白，它与细胞周期蛋白依赖性激酶结合，促使胶质瘤细胞从G1期顺利进入S期［14］，使细胞发生分裂与增殖，NF-κB的激活还可以通过抑制Caspase-3的产生以及增加Bcl-2的表达，从而抑制胶质瘤细胞凋亡的发生［15］。本研究发现，IKK 的选择性抑制剂IKK16可以明显抑制人胶质瘤细胞U87的增殖，其机制可能是通过抑制p65向细胞核内的转运从而抑制NF-κB 介导的下游因子CyclinD1的转录和表达相关，Caspase-3作为凋亡下游的关键执行者，IKK16可以明显增加Caspase-3促凋亡蛋白的表达，减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，这可能是IKK16促进胶质瘤细胞凋亡和抑制增殖的主要机制，此外，IKK16在动物实验中发现可以通过口服吸收，一旦进入临床可以大大简化给药方式，为了进一步验证其临床有效性，下一步需要进行动物体内实验，从而为临床实验打下坚实的理论基础。

综上所述，IKK 的抑制剂IKK16可以抑制胶质瘤细胞的增殖并促进胶质瘤细胞的凋亡，IKK16 未来可能成为治疗胶质瘤的一种新型药物，具有潜在的临床应用前景。

［1］ Solomon IH，Ramkissoon SH，Milner DA Jr，et al.Cytomegalovirus and glioblastoma：a review of evidence for their association and indications for testing and treatment［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2014，73（11）：994-998.

［2］ 李亮，边寰，张伟，等.中枢神经系统神经上皮细胞肿瘤的流行病学研究［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2013，12（5）：435-438.

［3］ 朱海波.低级别胶质瘤的手术治疗进展［J］.重庆医学，2012，41（13）：1338-1340.

［4］ 毛德强，潘玲，戴勤弼，等.术后放疗联合替莫唑胺治疗高级别胶质瘤的近期临床疗效及安全性观察［J］.重庆医学，2013，42（1）：21-23.

［5］ Olson JJ，Nayak L，Ormond DR，et al.The role of targeted therapies in the management of progressive glioblastoma：a systematic review and evidence-based clinical practice guideline［J］.J Neurooncol，2014，118（3）：557-599.

［6］ Nogueira L，Ruiz-Ontanon P，Vazquez-Barquero A，et al.The NFkappaB pathway：a therapeutic target in glioblastoma［J］.Oncotarget，2011，2（8）：646-653.

［7］ Waelchli R，Bollbuck B，Bruns C，et al.Design and preparation of 2-benzamido-pyrimidines as inhibitors of IKK［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16（1）：108-112.

［8］ Omuro A，DeAngelis LM.Glioblastoma and other malignant gliomas：a clinical review［J］.JAMA，2013，310（17）：1842-1850.

［9］ Munson J，Bonner M，Fried L，et al.Identifying new small molecule anti-invasive compounds for glioma treatment［J］.Cell Cycle，2013，12（14）：2200-2209.

［10］ Atkinson GP，Nozell SE，Benveniste ET.NF-kappaB and STAT3signaling in glioma：targets for future therapies［J］.Expert Rev Neurother，2010，10（4）：575-586.

［11］ Robe PA，Bentires-Alj M，Bonif M，et al.In vitro and in vivo activity of the nuclear factor-kappaB inhibitor sulfasalazine in human glioblastomas［J］.Clin Cancer Res，2004，10（16）：5595-5603.

［12］ Kauppinen A，Suuronen T，Ojala J，et al.Antagonistic crosstalk between NF-kappaB and SIRT1in the regulation of inflammation and metabolic disorders［J］.Cell Signal，2013，25（10）：1939-1948.

［13］ Hoesel B，Schmid JA.The complexity of NF-kappaB signaling in inflammation and cancer［J］.Mol Cancer，2013（12）：86.

［14］ Wang J，Wang Q，Cui Y，et al.Knockdown of cyclin D1 inhibits proliferation，induces apoptosis，and attenuates the invasive capacity of human glioblastoma cells［J］.J Neurooncol，2012，106（3）：473-484.

［15］ Shi L，Chen J，Yang J，et al.MiR-21protected human glioblastoma U87MG cells from chemotherapeutic drug temozolomide induced apoptosis by decreasing Bax／Bcl-2 ratio and caspase-3activity［J］.Brain Res，2010（1352）：255-264.