米非司酮在抑制卵巢癌细胞紫杉醇耐药产生的作用

柳杨

米非司酮在抑制卵巢癌细胞紫杉醇耐药产生的作用

柳杨

目的探讨米非司酮在抑制卵巢癌细胞株skov3、A2780对紫杉醇耐药产生的作用。方法在紫杉醇诱导卵巢癌细胞株skov3、A2780的过程中,使用不同浓度米非司酮,应用免疫组化方法比较受不同浓度米非司酮作用的各组细胞株的P糖蛋白(p-glyco-protein,P-gp)的表达,同时检测各细胞的生长曲线。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的半数致死浓度(IC50)；采用罗丹明123(Rh123)为荧光探针,使用流式细胞仪比较各株细胞的胞内Rh123含量。结果紫杉醇诱导卵巢癌耐药的过程中使用米非司酮,诱导后卵巢癌细胞株skov3、A2780中P-gp含量有所下降。结论米非司酮可抑制卵巢癌细胞紫杉醇耐药的产生。

米非司酮；卵巢癌；skov3；A2780；耐药

卵巢癌是妇科的常见恶性肿瘤之一,紫杉醇是治疗卵巢癌的一线用药[1]。临床上化疗耐药是导致卵巢癌化疗失败的主要原因[2]。本文模拟卵巢癌细胞产生紫杉醇耐药的过程,使用米非司酮为耐药逆转剂,探讨米非司酮在抑制卵巢癌细胞紫杉醇耐药产生的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞株skov3购于上海研晶生物科技有限公司,A2780购于上海拜力生物科技有限公司,两株细胞分别置于培养基含10％小牛血清的RPMI-1640、DMEM,并放于相对湿度90％、37℃、含5％CO2培养箱中培养。

1.2 试剂与药品 DMEM和RPMI-1640均购于Gibco公司,紫杉醇(Taxol)购于美国百时美施贵宝公司,SP免疫组化试剂盒购于北京北瑞达医药科技有限公司,罗丹明(Rohdamin123,Rh123)购于Sigma公司,鼠抗人MDR1单克隆抗体购于上海亿欣生物科技有限公司,米非司酮由浙江仙琚制药股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 Taxol诱导skov3 阳性对照组：取处于对数生长期skov3细胞,置于含有Taxol1.5 µmol/ml的10％小牛血清RPMI-1640培养液中作用1 h,然后使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次,之后使用不含紫杉醇的10％小牛血清RPMI-1640培养液养至skov3细胞的生长恢复对数生长。实验组：共三组,skov3细胞分别置于含紫杉醇1.5 µmol/ml的10％小牛血清RPMI-1640培养液内,再分别加入1、2.5、10 µm米非司酮,作用1 h,各组均行30次诱导。阴性对照组：skov3直接传代,不加紫杉醇。

1.3.2 Taxol诱导A2780 处理方法同skov3 细胞,但紫杉醇浓度为0.2 µmol/ml,培养液为10％小牛血清DMEM培养液。

1.3.3 细胞形态的观察及生长曲线的绘制 取对数生长期的各组细胞接种在24孔板上,5000个/孔,置于37℃、相对湿度90％及含5％CO2的培养箱中培养,细胞贴壁生长后,每天同一时间取其中3孔细胞行细胞计数,连续观察8 d,绘制各组的细胞生长曲线。

1.3.4 SP染色 使用3％H2O2孵育细胞爬片10 min,封闭后分别加入鼠抗人MDR1单抗(1：50),DAB显色、复染、脱水、封片,观察P-gp表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞经诱导后的形态

2.1.1 skov3细胞 阴性对照组：细胞均贴壁生长,光镜下细胞边界清晰,呈梭形上皮样生长,折光性好。阳性对照组：大部分细胞坏死或凋亡,存活细胞大小不一,形态不规则,边界模糊。诱导过程中细胞形态改变,突起增多,胞质有空泡,细胞畸形。实验组：三组实验组细胞均出现阳性对照组所见细胞特点,且米非司酮浓度越高,细胞坏死越严重。

2.1.2 A2780细胞 阴性对照组：细胞生长良好,形态较规则,透亮度高。阳性对照组：细胞体积变小,细胞呈团簇生长。实验组：细胞呈阳性对照组样特点,且米非司酮药物浓度越高,细胞坏死越严重。

2.2 各组细胞生长曲线 经Taxol诱导后,两株细胞的亚克隆筛选趋向于细胞生长周期较长或增殖不旺盛的细胞亚群。当加入米非司酮后该倾向性更明显,且米非司酮药物浓度越高,细胞亚克隆生长越不旺盛。见图1,图2。

图1 Taxol作用skov3后各组细胞生长曲线

图2 Taxol作用A2780后各组细胞生长曲线

2.3 经Taxol作用24 h后半数致死浓度(IC50) 经Taxol诱导30次后,两株细胞耐药性显著提高,与原代细胞相比,IC50明显提高(P＜0.05),提示细胞株经Taxol诱导后耐药性明显提高。使用米非司酮的各实验组与阳性对照组相比,耐药性显著下降(P＜0.05),且呈米非司酮浓度越高,耐药性下降越明显的趋势,见表1。

表1 各组细胞经紫杉醇作用24 h后的IC50(±s)

表1 各组细胞经紫杉醇作用24 h后的IC50(±s)

注：与阴性对照组比较,aP＜0.05；与阳性对照组比较,bP＜0.05

细胞株 组别 IC50(µmol/ml) skov3细胞株 阴性对照组 0.019±0.003阳性对照组 0.523±0.025a紫杉醇+1 µm米非司酮 0.426±0.021b紫杉醇+2.5 µm米非司酮 0.228±0.012b紫杉醇+10 µm米非司酮 0.150±0.009bA2780细胞株 阴性对照组 0.063±0.003阳性对照组 0.130±0.007a紫杉醇+1 µm米非司酮 0.114±0.005b紫杉醇+2.5 µm米非司酮 0.095±0.005b紫杉醇+10 µm米非司酮 0.084±0.004b

2.4 流式细胞仪检测荧光强度 经Taxol诱导后的细胞,荧光强度显著低于无诱导时(P＜0.01),使用不同浓度的米非司酮后,各实验组的荧光强度较仅使用Taxol的阳性对照组显著提高(P＜0.05),见表2,提示不同浓度的米非司酮可不同程度地增加罗丹明在两株细胞中的蓄积。2.5 免疫组化SP染色结果 P-gp在两株原代细胞中未见表达,而使用不同浓度米非司酮后的各组细胞均呈阳性表达,而单用Taxol诱导的两株细胞,呈强阳性表达。

表2 各组细胞荧光强度的比较(±s)

表2 各组细胞荧光强度的比较(±s)

注：与阴性对照组比较,aP＜0.01；与阳性对照组比较,bP＜0.05

细胞株 组别 荧光强度skov3细胞株 阴性对照组 94.1±3.0阳性对照组 18.6±2.7a紫杉醇+1 µm米非司酮 34.6±4.1b紫杉醇+2.5 µm米非司酮 64.5±4.3b紫杉醇+10 µm米非司酮 79.1±2.2bA2780细胞株 阴性对照组 98.5±1.4阳性对照组 46.5±2.2a紫杉醇+1 µm米非司酮 55.0±2.6b紫杉醇+2.5 µm米非司酮 73.1±3.3b紫杉醇+10 µm米非司酮 81.3±1.9b

3 讨论

目前,MDR基因及其表达物P糖蛋白介导多重耐药是肿瘤细胞耐药研究的热点,MDR基因的表达与肿瘤细胞对化疗药物耐药相关[3]。近年来有研究发现,米非司酮可逆转P糖蛋白介导的耐药[4]。目前发现多种肿瘤细胞多重耐药的产生与MDR1基因扩增和由其所致P-gp产生并增多相关[5]。米非司酮是一种作用于受体水平的孕激素拮抗剂[6],近年来研究表明,米非司酮对紫杉醇耐药的卵巢癌具有耐药逆转作用。

本文通过在使用紫杉醇诱导skov3、A2780细胞株产生耐药的过程中,使用米非司酮干预,观察各组细胞的生长曲线、IC50,并以Rh123为荧光探针比较各细胞内Rh123含量,探讨米非司酮抑制紫杉醇耐药性的产生。实验结果表明,经紫杉醇诱导后,两株细胞形态有所改变,使用米非司酮的细胞也出现类似变化,但加入高浓度米非司酮者细胞坏死明显,筛选出的亚克隆生长不旺盛,且使用米非司酮浓度越高,细胞的IC50越低,以上结果均表明米非司酮可保持卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。另外,采用流式细胞仪检测P-gp,米非司酮干预的细胞株中,Rh123荧光强度明显强于仅使用紫杉醇诱导的细胞株,表明米非司酮可增加Rh123在细胞内的蓄积,且米非司酮浓度越高,蓄积越多。提示米非司酮逆转耐药性可能与降低细胞非特异性外排相关。

综上所述,米非司酮对人卵巢癌细胞对紫杉醇耐药具有一定的逆转作用,且药物浓度越高,逆转作用越明显,对治疗卵巢癌具有重要价值。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.03.188

2014-10-29]

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