HPLC法测定牛磺熊去氧胆酸胶囊含量的临床分析

刘小双 蒲旭峰 欧世荣 杨蕊

HPLC法测定牛磺熊去氧胆酸胶囊含量的临床分析

刘小双 蒲旭峰 欧世荣 杨蕊

目的建立测定牛磺熊去氧胆酸胶囊含量的方法。方法采用KromasilC18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm), 流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(80%磷酸调pH至3.5), 梯度洗脱, 检测波长205 nm, 柱温30℃, 流速1.2 ml/min, 进样量20 μl。结果牛磺熊去氧胆酸在0.0953～1.9050 mg/ml范围内与浓度呈良好的线性关系(r=0.9999)；加样回收率为99.93%, RSD=1.0%(n=9)。结论采用高效液相色谱法(HPLC)测定牛磺熊去氧胆酸胶囊含量, 该方法简便准确、精密度和重复性良好, 结果准确可靠。

牛磺熊去氧胆酸胶囊含量；高效液相色谱法

牛磺熊去氧胆酸是熊胆汁的有效成分, 而且仅在熊胆汁酸中含有, 其化学名是2-｛[(3,5,7)-3α,7β-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]氨基｝乙烷磺酸, 二水合物[1], 分子式为C26H45NO6S·2H2O, 分子量为535.74, 是目前发现的人体内亲水性最强的胆汁酸, 是熊去氧胆酸在胆汁中的生理活性形式。牛磺熊去氧胆酸具有溶解胆固醇结石和保护肝细胞等多项生理功能。牛磺熊去氧胆酸胶囊由BruschettiniS.r.I.(意大利贝司迪大药厂)研制,2006年以商品名滔罗特获准在中国销售, 最新注册证号为H20110233, 规格为250 mg×20粒/盒。临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等[2-4]。牛磺熊去氧胆酸胶囊在国内外的药典中尚未见收载, 现采用HPLC测定牛磺熊去氧胆酸胶囊的含量, 操作方便, 专属性好, 结果准确, 重现性良好, 现报告如下。

1 材料来源

1.1 仪器 Agilent1200高效液相色谱仪 [Agilent1200G1311A四元泵, Agilent1200MWDG1365D检测器, Agilentchemstation化学色谱工作站(B.04.02)]；电子分析天平：METTLERT OLEDOXS105(0.1/0.01 mg)；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-1601型紫外分光光度计(日本岛津)；pHS-3C数字酸度计(上海精科仪器有限公司)。

1.2 试药 牛磺熊去氧胆酸钠对照品(购自美国TRC公司,批号：T009200), 甲醇、乙腈均为色谱纯(Sigma公司), 水为超纯水；其他试剂试药均为分析纯；市售滔罗特牛磺熊去氧胆酸胶囊(批号：0907、1165, 均由成都欣捷高新技术开发有限公司提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相为乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(80%磷酸调pH至3.5), 梯度洗脱(0 min,20%A；8 min,45%A；30 min,20%A)；柱温：30℃；检测波长：205 nm, 流速1.2 ml/min, 进样量20 μl。在上述色谱条件下, 理论板数按牛磺熊去氧胆酸计算不得低于6000, 拖尾因子不得过2.0。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称定经五氧化二磷减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸钠盐对照品10.47 mg(折合成牛磺熊去氧胆酸为10.01 mg)置于10 ml量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 摇匀得1.00 mg/ml牛磺熊去氧胆酸对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取牛磺熊去氧胆酸胶囊内容物,混匀, 研细, 精密称取32.07 mg(约相当于牛磺熊去氧胆酸25.04 mg), 置于25 ml量瓶中, 加入甲醇20 ml, 超声提取5 min, 放冷至室温, 再加甲醇定容至刻度, 摇匀, 经0.45 μm微孔滤膜过滤, 取续滤液作为牛磺熊去氧胆酸供试品溶液。

2.3 方法专属性考察 取处方量辅料按2.2.2项下方法制备辅料空白溶液, 再采用2.1项色谱条件, 分别精密量取20 μl牛磺熊去氧胆酸对照品溶液、供试品溶液、辅料空白溶液注入高效液相仪进行测定, 记录色谱图, 结果空白辅料在与牛磺熊去氧胆酸对照品峰相同的保留时间处无色谱峰出现, 表明空白辅料对牛磺熊去氧胆酸样品的检测无干扰。见图1。

图1 对照品(A)、供试品(B)、辅料空白(C)HPLC方法专属性考察色谱图

2.4 线性关系考察 精密称取牛磺熊去氧胆酸对照品10.12 mg置于5 ml容量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 作为对照品贮备液(2.02 mg/ml)。以进样浓度10%～200%的浓度范围内取6个浓度点(即10%、20%、50%、100%、120%、200%)进行线性回归。以对照品浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y), 绘制标准曲线, 得线性回归方程：Y=4.593×106X+8788(r=0.9999), 表明牛磺熊去氧胆酸在0.0953～1.9050 mg/ml范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密量取2.2.1项下的牛磺熊去氧胆酸对照品溶液20 μl连续进样5次, 测得5次峰面积RSD=0.42%(n=5), 说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取同一批号(1165)的样品适量, 按2.2.2项方法制备供试品溶液, 平行操作6份, 在上述色谱条件下, 测得牛磺熊去氧胆酸平均含量为99.87% RSD=0.56%,表明该方法重复性较好。

2.7 供试品溶液的稳定性试验 精密称取同一批号(1165)样品6份, 按2.2.2项方法制备供试品溶液, 分别于配制后的0、2、4、8、24、48 h按上述色谱条件进样测定, 记录峰面积,牛磺熊去氧胆酸峰面积在48 h内RSD=0.18%, 结果表明牛磺熊去氧胆酸在48 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 按处方比例, 取低(80%)、中(100%)、高(120%)3个不同浓度的牛磺熊去氧胆酸对照品, 分别加入处方量辅料, 混匀, 精密称取适量(约相当于牛磺熊去氧胆酸对照品8、10、12 mg), 按2.2.2项下处理后, 进样20 μl, 记录色谱图。另取牛磺熊去氧胆酸对照品储备液, 同法测定,按外标法计算,3种含量的样品中牛磺熊去氧胆酸的回收率分别为99.76%、99.81%、100.23%, 平均回收率为99.93%, RSD=0.26%。

2.9 样品测定 分别精密量取20 μl牛磺熊去氧胆酸对照品溶液和供试品溶液, 按照2.1项色谱条件注入高效液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法计算2批牛磺熊去氧胆酸胶囊样品的含量, 结果分别为标示量的99.76%(0907)和99.83% (1165)。

3 讨论

3.1 实验中取牛磺熊去氧胆酸对照品溶液在200～400 nm的波长范围内扫描, 结果牛磺熊去氧胆酸仅有末端的紫外吸收,与张晓艳等[5]的研究一致, 考虑溶剂响应的影响, 因此将205 nm作为检测波长。

3.2 曾参考相关文献[5]甲醇0.05 mol/L磷酸二氢钠(磷酸调节pH值4.5)(60：40)为流动相, 峰形不理想, 经比较, 采用本文流动相牛磺熊去氧胆酸主峰保留时间适中, 且峰形较满意。试验结果显示, 线性关系、精密度、重复性等均能满足用于牛磺熊去氧胆酸胶囊含量的测定。

3.3 在采用HPLC法测定牛磺熊去氧胆酸的含量时, 多以牛磺熊去氧胆酸钠作为对照品, 计算结果再折算到牛磺熊去氧胆酸的含量, 与高鹏[6]的研究一致。

[1]王海龙, 吴成龙, 邓勇, 等.牛磺熊去氧胆酸的合成.中国医药工业杂质,2009,40(2):88-89.

[2]沈俊, 周聃, 张若丹, 等. HPLC测定风热清胶囊中的绿原酸和牛磺熊去氧胆酸.华西药学杂志,2008,23(3):346-348.

[3]骆助林, 陈理国, 苗建国, 等.保胆取石术后口服牛磺熊去氧胆酸预防结石复发的临床观察.中国循证医学杂志,2011,11(6):644-646.

[4]傅贤波, 林三仁, 范竹萍, 等.牛磺熊去氧胆酸溶解胆囊胆固醇结石有效性和安全性—随机、双盲、安慰剂对照、多中心临床研究.中国微创外科杂志,2007,7(12):1159-1163.

[5]张晓艳, 崔蕊, 贾建静, 等. HPLC测定牛磺熊去氧胆酸胶囊中的有关物质.华西药学杂质,2012,27(5):585-587

[6]高鹏. HPLC法测定消痔软膏中牛磺熊去氧胆酸的含量.山东中医杂志,2011,30(3):198-199.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.16.194

2015-03-24]

611137 成都中医药大学药学院(刘小双 蒲旭峰)；成都欣捷高新技术开发有限公司(欧世荣 杨蕊)