昙花中槲皮素、异鼠李素和山奈酚量的测定

邹 翔，盛洁静，曲中原，张振国，徐 阳，季宇彬

(1. 哈尔滨商业大学 药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076；3. 哈尔滨商业大学 英才学院，哈尔滨 150028)

昙花中槲皮素、异鼠李素和山奈酚量的测定

邹 翔1，盛洁静2，曲中原2，张振国3，徐 阳3，季宇彬1

(1. 哈尔滨商业大学 药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076；3. 哈尔滨商业大学 英才学院，哈尔滨 150028)

建立高效液相法同时测定昙花中含槲皮素、山奈酚和异鼠李素的量.运用Diamonsil C18色谱柱为分析柱，以甲醇-0.4%磷酸水溶液(55∶45)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm.测得槲皮素在5.5～88 μg/mL范围内呈良好线性关系，r=0.999 9(n=6)；山奈酚在4～64 μg/mL范围内呈良好线性关系，r=0.999 9(n=6)；异鼠李素在6.5～104 μg/mL范围内呈良好线性关系，r=0.999 9(n=6)，三者的回收率分别为(99.84±0.23)%(RSD=0.24%)、(100.20±0.52)%(RSD=0.38%)、(99.99±0.12)%(RSD=0.11%).槲皮素、异鼠李素和山奈酚的量分别为0.05、0.026、0.039 mg/g.本方法可同时测定昙花中槲皮素、异鼠李素和山奈酚，操作简单、灵敏、重复性好，适用于昙花及其制剂的质量控制.

昙花；槲皮素；山奈酚；异鼠李素；高效液相色谱法

昙花[Epiphyllum oxypetalum (DC.)Haw]为仙人掌科昙花属多年生常绿肉质植物，除了具有较强的观赏性外，作为日用品和化妆品添加剂方面有所应用[1].据《中华本草》记载，昙花出自《陆川本草》，其花和茎均可入药，具有清肺止咳、凉血止血、养心安神之功效，临床上多用于治疗肺热咳嗽、肺痨、咳血、崩漏、心悸、失眠等[2].含有丰富的Fe、Zn、Mn和Cu等微量元素，具有一定的药用和食用价值[3].昙花主要成分为黄酮类化合物，其中苷元以槲皮素、异鼠李素和山奈酚为主[4].槲皮素、异鼠李素和山奈酚均有止咳、祛痰、平喘的药理作用，与昙花的功效作用相符[5-7].目前，尚未见关于昙花质量控制研究的相关报道.本文采用高效液相色谱法测定昙花中含黄酮类成分槲皮素、异鼠李素和山奈酚的量，为昙花药材的质量评价及昙花药用资源的开发和利用奠定基础.

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200系列高效液相色谱仪(江苏舜星科技有限公司)；Diamonsil C18色谱柱(5 μm 200×4.6 mm)；JM型电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(江苏省常州市恒久仪器制造有限公司)；BSA124S分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；KQ5200DB型数显超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SB-2000型水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)；SHB-111型循环水式多用真空泵(郑州世纪双科实验仪器有限公司)；DK-98-11型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；DHG-9023型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；N-1000型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；LD4-2A型低速离心机(北京京立离心机有限公司).

1.2 试剂

甲醇(色谱纯)、盐酸(色谱纯)、乙醇(分析纯)、磷酸(扬州沪宝化学试剂有限公司)，娃哈哈纯净水(天津娃哈哈集团有限公司).

1.3 药材、标准品

昙花为仙人掌科植物昙花(Epiphyllumoxypetalum(DC.)Haw)的干燥花(购自安徽亳州本草药业，经哈尔滨商业大学药学院张德连教授鉴定).槲皮素对照品(批号 AB131Q-a)、山奈酚对照品(批号 AB395K)、异鼠李素对照品(批号 AB1251)，均购自天津一方科技有限公司.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱为分析柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(55∶45)，流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm，柱温为室温；进样量为10 μL.

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液制备

精密称取槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品分别为5.5、6.5、4.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得槲皮素0.11 mg/mL，异鼠李素0.13 mg/mL，山奈酚0.08 mg/mL液的混合标准品溶，4 ℃保存，备用.

2.2.2供试品溶液制备

称取昙花粉末20g置于圆底烧瓶中，80%乙醇400 mL，80 ℃热回流提取2次，4 h/次，提取液过滤、浓缩、定容至100 mL[8].过滤后取续滤液60 mL，浓缩后用甲醇定容至10 mL.取4 mL上述溶液，加甲醇溶液4 mL和25%盐酸溶液2 mL于具塞试管中进行酸化处理，将试管置于95 ℃水浴加热4 h，中途搅拌30 min，在冰水中速冷后转移至10 mL量瓶，甲醇补足体积，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，得供试品溶液[9-10].

2.3 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL分别置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得系列对照品溶液.上述标准溶液分别进样10 μL，测定吸收峰面积.按“2.1”项下色谱条件进样分析并记录峰面积.以质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程分别为槲皮素Y= 41 937X-44.997，r=0.999 9；山奈酚Y= 36 989X-54.253，r=0.999 9；异鼠李素Y= 64 930X-55.293，r=0.999 9.结果表明槲皮素、山奈酚、异鼠李素质量浓度分别在5.5～88、4～64、6.5～104 μg/mL内与峰面积呈良好的线性关系.

2.4 方法学考察

2.4.1精密度实验

按“2.1”项下色谱条件，精密吸取昙花提取溶液10 μL，同时测定槲皮素、山奈酚和异鼠李素的色谱峰峰面积，连续测定6次，RSD值分别为1.2%、1.6%、1.2%(n=6)，表明仪器精密度良好.

2.4.2稳定性试验

按“2.1”项下色谱条件，取昙花提取溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样10 μL，同时测定槲皮素、山奈酚和异鼠李素的色谱峰峰面积，RSD值分别为0.3%、0.5%、0.6%(n=6)，表明对照品溶液在10 h内基本稳定.

2.4.3重复性试验

按“2.2”项方法取昙花粉末6份，按上述热回流提取方法平行制备，取昙花提取溶液，分别进样10 μL，按“2.1”项下色谱条件，同时测定槲皮素、山奈酚和异鼠李素色谱峰峰面积，RSD值分别为1.0%、1.4%、1.1%(n=6)，表明该方法重复性良好.

2.4.4回收率试验

精密量取昙花粉末50 g(含有0.005%槲皮素、0.002 6%山奈酚和、0.003 9%鼠李素和0.011 4%总黄酮)，按“2.2”项下进行提取，取续滤液定容至25 mL.取6份上述溶液，每份4 mL，分别加入混合对照品溶液2 mL，甲醇溶液2 mL和25%盐酸溶液2 mL于具塞试管中进行酸化处理，0.45 μm滤膜滤过，得供试品溶液.按“2.1”项下色谱条件，进样10 μL，测定槲皮素、山奈酚和异鼠李素的量，计算槲皮素的回收率为(99.84%±0.23)%，RSD值为0.24%(n=6)；山奈酚的回收率为100.20%±0.52%，RSD值为0.38%(n=6)，异鼠李素的回收率为(99.99%±0.12)%，RSD值为0.11%，表明该测定结果准确.

表1 昙花中槲皮素、山奈酚和异鼠李素的回收率实验结果

2.5 测定

取供试品溶液，进样10 μL按“2.1”下色谱条件进样分析并记录峰面积.HPLC测定结果见图1，表2.昙花中含槲皮素、异鼠李素和山奈酚的量分别为0.05、0.026、0.039 mg/g.

图1 对照品与供试品的HPLC色谱图A—对照品；B—供试品 1—槲皮素；2—山奈酚；3—异鼠李素

表2 昙花中含槲皮素、山奈酚、异鼠李素的量

3 结 语

本文采用一测多评，建立高效液相色谱法同时测定昙花中含槲皮素、异鼠李素和山奈酚的量的方法，操作简单、灵敏、重复性好，能够更加有效、全面、准确地控制昙花及其制剂的质量.一测多评的研究方法实现了中药多成分定量，更加符合传统中医理论的整体观，为中药多指标质量评价提供了新的研究思路，将越来越广泛地应用于中药科研和生产实践过程中，成为中药质量控制和评价模式发展新趋势.参考文献：

[1] SUZAKI S. Moisturizing effect of Gekkabijin (Epiphyllum oxypetalum Haw.) extract [J]. Fragra J, 2005, 33(10): 51-56.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1999. 864-865.

[3] 陈燕丹, 黄明楷, 林 珊, 等. FAAS测定昙花中的7种金属元素[J]. 光谱实验室, 2011, 28(3): 1206-1208.

[4] 吴 斌, 林文辉. 昙花化学成分的研究[J]. 中国药学杂志, 2010, 45(7): 496-499.

[5] 谢 娟, 宋良科, 王 恒, 等. 矮地茶的槲皮素与山奈酚含量测定[J]. 特产研究, 2008(1): 55-57.

[6] 易长英. 高效液相色谱法测定复方矮地茶止咳合剂中的槲皮素和山奈酚含量[J]. 中南药学, 2014(1): 66-69.

[7] 陈羽鹏, 苏连彩, 丘建芳, 等. RH-HPLC法测定祛痰止咳颗粒中槲皮素的含量[J]. 中医药导报, 2006(3): 56-57, 68.

[8] 张振国, 邹 翔, 徐 阳, 等. 昙花总黄酮提取工艺[J]. 哈尔滨商业大学学报：自然科学版, 2015, 31(2): 129-131, 142.

[9] 姜 帆, 杨星钢, 郭迎新, 等. 银杏叶制剂溶出液中槲皮素、山奈素与异鼠李素的HPLC测定方法研究[J]. 沈阳药科大学学报, 2013, 30(9): 691-695.

[10] 黄成钢，闫新佳，邹晓祺，等.青龙衣的化学成分和抗肿瘤活性研究[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2014，30(5)：517-521，541.

Simultaneous determination of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Epiphyllum oxypetalum by HPLC

ZOU Xiang1, SHENG Jie-jing2, QU Zhong-yuan2, ZHANG Zhen-guo3, XU Yang3, JI Yu-bin1

(1. PostDoctoral Research Center of Material Medica, Harbin University of Commrce, Harbin 150076, China;2.School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 3. Honours School,Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China)

A rapid and sensitive HPLC method was developed to detect the content of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Epiphyllum oxypetalum. Diamond-C18column was used as chromatographic column, methanol-0.4% phosphoric acid (55∶45) water solution as mobile phase, and the detection wavelength was set at 360 nm, with a flow rate at 1.0 mL/min. There was a good linear relationship when quercetin was in the range of 5.5～88 μg/mL,r=0.999 9(n=6), kaempferol was in the range of 4～64 μg/mL,r=0.999 9(n=6) and isorhamnetin was in the range of 6.5～104 μg/mL,r=0.999 9(n=6). The average recoveries were (99.84±0.23)% (RSD=0.24%), (100.20±0.52)% (RSD=0.38%), 99.99±0.12% (RSD=0.11%) respectively. The result showed that the content of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Epiphyllum oxypetalum were 0.05, 0.026, 0.039 mg/g, respectively. The established method was simple, sensitive and reproducible to detect the content of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Epiphyllum oxypetalum at the same time, which could be applied in the quality control of Epiphyllum oxypetalum and its preparations.

Epiphyllum oxypetalum; quercetin; kaempferol; isorhamnetin; HPLC

2015-06-02.

国家自然科学基金青年基金项目(81102858)；黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划(UNPYSCT-2015070)；黑龙江省博士后资助项目(LBH-Z11102)；哈尔滨商业大学大学生创新创业训练计划国家级项目(201410240007)

邹 翔(1978-)，男，博士，副研究员，研究方向：抗肿瘤天然药物研究.

R284

A

1672-0946(2015)05-0513-03