分子印迹固相萃取膜－高效液相色谱法检测粮谷中腈菌唑残留

王姣姣 庞 军 刘 博 高文惠

(河北科技大学生物科学与工程学院河北省发酵工程技术研究中心，石家庄 050000)

腈菌唑是一种高效、低毒、具有保护作用的内吸杀菌剂，主要用来防治由黑星菌属(Venturia)和核盘菌属(Sclerotinia)引起的果树病害，以及球腔菌属(Mycosphaerella)引起的小麦等谷物病害和花生叶斑病。但是腈菌唑的不合理使用会造成农药残留，进而对人体和动物体内分泌产生不良影响，主要表现在损害神经系统，降低生物体的免疫能力并诱发肿瘤等。

分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)是制作能够特异性吸附模板物质的一项尖端技术。分子印迹的核心就是制备出具有高选择性分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)，其他一切应用都是围绕MIPs进行的［1］。近几年分子印迹技术主要集中于应用研究，如在色谱分离［2－3］、固相萃取［4－7］、传感器［8－11］等领域得到广泛应用。

目前研究分子印迹固相萃取技术主要集中于分子印迹固相萃取柱的制备与应用方面，而对于分子印迹固相萃取膜(molecularly imprinted solid phase extraction membrane，MISPEM)的研究鲜见报道［12－13］。本试验通过原位聚合法制备腈菌唑分子印迹固相萃取膜，并应用于食品中腈菌唑残留的检测。分子印迹膜不仅具有传统膜技术的稳定性、连续性和节能性的优点，而且同时具备新兴分子印迹技术预定性、选择性和专一性的特点，采用分子印迹固相萃取膜对复杂基质样品进行前处理具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微孔滤膜(0.45μm尼龙膜):上海市新亚净化器件厂;腈菌唑(myclobutanil，纯度97.7%):江苏耕农化工有限公司;丙烯酰胺(AM，分析纯):天津金汇太亚化学试剂有限公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，分析纯):抚顺安信化学有限公司;偶氮二异丁腈(AIBN，化学纯):天津市大茂化学试剂厂;甲醇、乙腈(色谱纯):天津市光复精细化工研究所。

大米、小麦、黑米等样品:市售。

100μg/mL腈菌唑标准储备液的配制:准确称取2.5 mg腈菌唑标准品于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀。

1.2 仪器与设备

LC－20A高效液相色谱仪:日本岛津公司;TU－1810紫外可见分光光度计:北京普析通用有限责任公司;KH5200型超声波清洗器:昆山禾创超声仪器有限公司;HH－4型恒温水浴锅:江苏省金坛市宏华仪器厂。

1.3 采用紫外光谱法选择致孔剂

称取适量的腈菌唑，分别用乙腈、四氢呋喃和乙酸乙酯溶解，配制成浓度1 mmol/L溶液。当乙腈作为致孔剂时，在腈菌唑的乙腈溶液中分别加入一定量的AM乙腈溶液，配成模板物质与功能单体浓度比为 1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，以四氢呋喃和乙酸乙酯为致孔剂的溶液配制同上，用对应致孔剂为空白，测定其紫外光谱变化。

1.4 腈菌唑分子印迹固相萃取膜的制备

将0.2 mmol腈菌唑和0.4 mmol丙烯酰胺(AM)置于50 mL的圆底烧瓶中，加致孔剂乙腈15 mL，超声1 h，再加交联剂 EDMA 1.5 mL和引发剂 AIBN 0.02 g，将尼龙膜浸入液体内，超声30 min，把膜取出置于2片载玻片中间并固定2个载玻片位置，将载玻片放入自制真空瓶内，通入N2脱氧15 min，抽真空1 min后密封，在55℃恒温水浴锅中静置24 h，得到含模板物质的分子印迹固相萃取膜。将该分子印迹膜用甲醇∶乙酸(体积比95∶5)洗脱至无模板物质，再用甲醇浸泡1 h除去残留的乙酸，将浸泡后的分子印迹膜干燥6 h，即得到腈菌唑分子印迹固相萃取膜。

1.5 样品的提取

分别称取5.000 g样品(小麦、大米或黑米)，捣碎、研磨，用20 mL乙腈提取(分2次提取)，混匀，在常温下超声提取15 min，于4 000 r/min离心10 min，吸取上清液1 mL过自制的腈菌唑分子印迹固相萃取膜，用5 mL水淋洗，待排净淋洗液后，用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，并用甲醇定容至3 mL经0.45 μm的微孔滤膜过滤，待用液相色谱仪测定。

1.6 色谱条件

色谱柱:Promosil C18(4.6 ×150 mm，5 μm)，检测波长210 nm，流动相为甲醇－水(体积比80∶20)，流速1 mL/min，柱箱温度为25℃，进样量20μL。

2 结果与讨论

2.1 制备MIP时致孔剂选择研究

腈菌唑的结构式如图1所示，它在不同极性的溶剂中紫外吸收光谱有所不同。在乙腈中随着腈菌唑与AM浓度比的增加，溶液最大吸收波长发生红移，从196 nm红移到200 nm，红移量为4 nm，而且从图2a可知随着AM加入量增加溶液吸收强度增大，结果表明腈菌唑与AM之间产生了较强的分子间作用力。

图1 腈菌唑结构式

图2 在不同致孔剂中不同浓度比的腈菌唑与AM的紫外扫描图

在四氢呋喃中随着腈菌唑与AM浓度比增加，溶液最大吸收波长也发生红移，由228 nm红移到230 nm，红移了2 nm;从图2b可知，随着AM加入量增加，溶液的吸收峰略有增强，结果表明腈菌唑与AM之间也产生了分子间作用力，但作用力的强度比上述情况弱。

由图2c可知，在乙酸乙酯中，随着腈菌唑与AM浓度比增加，溶液最大吸收波长未发生红移，而且随着AM加入量增加，溶液的吸收强度也未发生变化。结果表明，当乙酸乙酯作为致孔剂时，腈菌唑与AM之间未发生明显的分子间作用力。综上所述，本试验选择乙腈为制孔剂。

2.2 分子印迹膜印迹次数对液体通过性的影响

分子印迹膜是通过原位聚合法在尼龙丝网上形成分子印迹聚合物，这种采用尼龙为基材的方法大大加强了膜的机械强度，使膜可以重复使用，经重复萃取试验结果表明，该膜可以连续萃取30次，而性能不衰减，如图3所示，但是聚合物的形成会造成尼龙膜孔穴不同程度的堵塞。试验考察了在膜上聚合一次和两次对液体通过性的影响。研究结果表明，在膜表面印迹2次，其通过性较差，需使用较大的压力才能使液体通过膜，且流出液浑浊，这是由于压力过大印迹聚合物脱落所致。在尼龙膜表面印迹2次的印迹膜，其通过性良好，重力作用就可以使液体通过，且流出液无浑浊现象。故试验采用1次印迹制备分子印迹固相萃取膜。

图3 分子印迹固相萃取膜制备示意图

2.3 淋洗液和淋洗液用量的选择

本试验考察了乙腈和水作为淋洗液时对样品净化效果的影响。将100μg/mL的腈菌唑标准溶液上样1 mL，分别采用乙腈和水淋洗，将收集到的各淋洗液按照1.6色谱条件进行测定。试验结果表明，乙腈可将模板物质淋洗下来，不适合作为淋洗液。水作淋洗液无此现象。

选用水作为淋洗液，分别用1、3、5 mL水淋洗时，其流出液上机测定有响应，但无腈菌唑物质峰出现，表明水可以将杂质洗去，但不会将模板物质淋洗下来，适合作为淋洗液;当用大于5 mL水淋洗之后上机检测无响应信号，说明已将杂质淋洗完全，所以本试验采用5 mL水作为最佳淋洗液用量。

2.4 洗脱剂和洗脱剂用量的选择

试验考察了甲醇和乙腈分别作为洗脱剂对印迹膜中目标物腈菌唑洗脱效果的影响。将100μg/mL的腈菌唑标准溶液1 mL上样，并进行洗脱，将收集到的洗脱液上机进行测定。结果表明甲醇作为洗脱剂时腈菌唑的峰面积大于乙腈作为洗脱剂时的峰面积，由此可知，甲醇的洗脱效果比乙腈好，因此选择甲醇为洗脱剂。

取1 mL 100μg/mL腈菌唑标准溶液过自制分子印迹固相萃取膜，分别选取

1、3、5 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液上机检测。结果为当收集到的洗脱液大于3 mL时，已经检测不到腈菌唑，说明3 mL甲醇可以将模板物质洗脱完全。故洗脱剂用量为3 mL。

2.5 检测波长的选择

对腈菌唑进行紫外光谱扫描，以确定液相色谱的检测波长。由扫描结果可知腈菌唑的最大吸收波长为196 nm，但甲醇在190～208 nm之间有吸收，综合考虑，选择210 nm为最佳检测波长。

2.6 流动相的选择

采用甲醇－水混合溶液作为流动相，考察了甲醇 －水体积比分别为 100∶0、90∶10、80∶20和 70∶30时腈菌唑的保留情况。结果表明，当流动相比例为80∶20时，腈菌唑的保留值适宜，分析时间较短，见图4所示。因此选择体积比为80∶20的甲醇－水作为流动相。

图4 腈菌唑标准溶液色谱图

2.7 线性关系与检出限

将腈菌唑分别配制成质量浓度为 0.3，0.5，1，2，5，10，20，50，100 μg/mL 的一系列标准溶液，在 1.6色谱条件下进行测定，并绘制腈菌唑的线性关系曲线。其线性关系和检出限见表1。

表1 线性方程、线性关系及检测限

2.8 腈菌唑分子印迹固相萃取膜对样品的净化和吸附作用

分子印迹固相萃取膜是利用非共价键作用对目标物质进行吸附，通过淋洗液将杂质去除，然后利用洗脱液将目标物洗脱下来。由图5a、图5b和图6a、图6b可知，分子印迹固相萃取膜对样品净化效果好，对杂质不具有吸附能力。由图5c和图6c可知，分子印迹固相萃取膜对模板物质表现出高选择性吸附能力，表明它从复杂基质中富集目标物的优越性能。

图5 腈菌唑MISPEM对黑米样品净化和吸附效果的色谱图

图6 腈菌唑MISPEM对小麦样品净化和吸附效果的色谱图

2.9 方法回收率和精密度试验

在最佳试验条件下对大米、小麦和黑米样品在0.5μg/mL和5μg/mL 2个添加水平下，进行加标回收率试验，分析结果如表2所示，平均回收率在80.2% ～86.0% 之间，相对标准偏差(RSD)在1.2%～3.3%之间(n=5)。结果表明该方法的回收率和精密度良好。

表2 样品的回收率和精密度试验(n=5)

3 结论

采用原位聚合法制备出腈菌唑分子印迹固相萃取膜，通过紫外光谱试验考察了制备印迹膜时致孔剂的选择，同时考察了分子印迹膜印迹次数对液体通过性的影响，最后将其应用到粮谷样品的前处理，建立了腈菌唑分子印迹固相萃取膜－高效液相色谱法检测粮谷中腈菌唑残留的方法。试验结果表明，当乙腈作为致孔剂时，腈菌唑与AM之间产生了较强的分子间作用力，并且在尼龙膜表面印迹一次的印迹膜，其通过性良好，在0.3～20μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性相关系数为0.999 4，相对标准偏差(RSD)≤3.3%(n=5)，平均回收率在80.2% ～86.0%之间，检出限为1.2μg/g，与传统的固相萃取相比，腈菌唑分子印迹固相萃取膜能够有效地去除粮谷样品中的杂质，并且选择性富集粮谷样品中腈菌唑残留。该方法灵敏、可靠，适用于粮谷样品中腈菌唑残留的分析。

［1］郑平，姚剑，徐业平.分子印迹固相萃取技术及其在食品安全分析中的应用［M］.合肥:合肥工业大学出版社，2011:30

［2］欧俊杰，董靖，吴明火，等.分子印迹整体柱在高效液相色谱和电色谱手性分离中的应用［J］.色谱，2007，25(2):129－134

［3］辛军红.分子印迹固相萃取与气相色谱联用检测蔬菜中有机磷农药多残留的研究［D］.泰安:山东农业大学，2012

［4］Bakas I，Ben Oujji N，Moczko E，et al.Molecular imprinting solid phase extraction for selective detection of methidathion in olive oil［J］.Analytica chimica acta，2012，734:99－105

［5］Chen X，Zhang Z，Yang X，et al.Molecularly imprinted polymers based on multi－walled carbon nanotubes for selective solid－phase extraction of oleanolic acid from the roots of kiwi fruit samples［J］.Talanta，2012，99:959 －965

［6］宋兴良.分子印迹固相萃取材料的制备及应用研究［D］.青岛:中国海洋大学，2010

［7］龚艳茹，王玥，董佳斌，等.异丙威表面分子印迹材料的制备及其识别特性研究［J］.分析化学，2014，42(1):28－35

［8］Liang R，Zhang R，Qin W.Potentiometric sensor based on molecularly imprinted polymer for determination of melamine in milk［J］.Sensors and Actuators B:Chemical，2009，141(2):544－550

［9］Chen X，Qing H，Yang W，et al.Amperometric detection of dopamine in human serumby electrochemical sensor based on gold nanoparticles doped molecularly imprinted polymers［J］.Biosensors and Bioelectronics，2013，49:199－203

［10］刘晓乐.分子印迹聚合膜在电化学传感器中的应用［D］.兰州:西北师范大学，2012

［11］魏小平，常川，李建平.分子印迹电化学传感器选择性识别及电催化检测多巴胺［J］.化学学报，2013，71(6):951－956

［12］邴乃慈，许振良，王学军，等.左氧氟沙星分子印迹膜固相萃取选择性分离氧氟沙星［J］.华东理工大学学报(自然科学版)，2007，33(2):163 －166

［13］王靖宇.分子印迹膜制备及其膜色谱的应用研究［D］.上海:华东理工大学，2010.