三疣梭子蟹幼蟹的蛋氨酸需要量

金 敏 王猛强 霍雅文 黄文文 候迎梅 丁立云 周歧存

(宁波大学海洋学院，鱼类营养研究室，宁波 315211)

蛋氨酸是一种含硫氨基酸，也是一种十分重要的氨基酸并参与蛋白质的合成［1］。在大多数植物蛋白质源中，蛋氨酸被认为是第一限制性氨基酸，然而，近年来由于鱼粉资源匮乏，造成价格攀升，因此越来越多的植物蛋白质源用以替代鱼粉而被应用于饲料配方中［2］。有研究表明，饲料中蛋氨酸含量不足会导致氨基酸组成不平衡，进而造成饲料利用水平下降，蛋白质合成降低，甚至影响动物的生长性能［1，3］。L－蛋氨酸参与了生物体内许多代谢反应，如S－腺苷甲硫氨酸(SAM)的合成［4］，以及 L－半胱氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、硫酸盐类、卵磷脂以及其他磷脂的合成［5］。L－蛋氨酸还是一种生糖氨基酸，参与D－葡萄糖和糖元的形成［1］。然而，当饲料中加入过量的蛋氨酸时，会导致机体中毒，从而影响生长［6］，蛋氨酸中毒现象可能是因肝脏中积累过多的SAM造成的［7］。因此，需要研究动物对饲料中蛋氨酸的适宜需求量，对于研制科学合理的人工配合饲料配方具有重要意义。

目前关于水生动物对蛋氨酸需要量的研究主要集中于鱼类，例如大西洋鲑(Salmo salar)［8］、尖吻鲈(Lates calcarifer)［9］、斑点叉尾 (Ictalurus punctatus)［10］、军 曹鱼 (Rachyentron canadum)［11］及欧洲鲈鱼(Dicentrarchus labrax)［12］等都已有相关报道;对甲壳类的蛋氨酸需求的研究中，已有报道得出大西洋沟虾(Palaemonetes varians)对饲料中蛋氨酸需要量为0.9%～1.1%(占饲料蛋白质的2.0% ～2.4%)［13］、日本对虾(Marsupenaeus japonicus)为 0.7%(占饲料蛋白质的 1.4%)［14］、斑节对虾(Penaeusmonodon)为0.9%(占饲料蛋白质的2.4%［15］或 2.9%［16］)、凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)为 0.89%(占饲料蛋白质的 2.16%)［17］，叶金云等［18］对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)研究认为其对饲料中蛋氨酸的需要量为1.12%(占饲料蛋白质的2.95%)。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)主要养殖区域分布在中国的沿海地区，以及韩国和日本等国［19－24］，其生长速度快，味道鲜美，市场价值高，历来深受消费者的欢迎。到2012年，国内三疣梭子蟹养殖产量已达到99 580 t［25］，然而，目前三疣梭子蟹的养殖大多依赖于投喂冰鲜鱼，关于其饲料营养需求研究［23－24，26］较少，也尚未有蛋氨酸需要量的报道。因此，本试验设计在相同的基础饲料中添加不同水平的蛋氨酸，对三疣梭子蟹幼蟹开展养殖试验，研究饲料蛋氨酸含量对其生长性能、常规营养成分、肌肉氨基酸组成的影响，确定三疣梭子蟹幼蟹对蛋氨酸的适宜需要量。

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1 材料与方法

1.1 试验饲料配制

本试验以鱼粉、小麦蛋白粉、豆粕和磷虾粉为蛋白质源，鱼油和豆油(1∶1)为脂肪源配制6组等氮等能(粗蛋白质 49.5%，总能 18.2 MJ/kg)的试验饲料，饲料中晶体L－蛋氨酸的添加水平分别为0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和 1.25%，实测各饲料蛋氨酸含量分别为 0.61%、0.77%、0.97%、1.18%、1.44%和 1.64%。试验饲料组成及营养水平见表1，试验饲料的氨基酸组成见表2。在配制试验饲料之前，各种原料经粉碎机粉碎后过80目筛，然后按照表1的配方准确称量各种饲料原料，各种维生素和矿物质的混合物等微量添加成分采取逐级扩大法混合均匀，再添加油和大豆卵磷脂混合均匀，将混合好的原料全部倒入混合机中，边混合边加水，约加至35%左右的水分，用双螺杆挤压机(F－26华南理工大学机械工程研究所制造)压制成粒径为3和5 mm的饲料，再用制粒机(G－250华南理工大学机械工程研究所制造)切割制粒，置90℃烘箱中熟化30 m in，取出自然风干至含水分在10%左右，最后放入做好标记的封口袋中于－20℃冷冻保存备用。

续表1

表2 试验饲料的氨基酸组成(干物质基础)Table 2 Am ino acid composition of experimental diets(DM basis) %

续表2

1.2 试验管理

饲养试验在浙江宁波象山鑫亿鲜活水产有限公司的养殖基地进行，试验所用的三疣梭子蟹幼蟹购自象山兢业育苗厂，选用当年人工孵化的同一批蟹苗。正式试验前，试验蟹一直暂养于1亩(1亩=677 m2)左右的水泥池中，并以商业饲料饱食投喂，暂养 2周。选择(11.27±0.13)g的幼蟹为试验对象，进行分组试验。本试验采用单体框养的养殖模式，选取360只大小规格一致的健康幼蟹随机放在180个塑料筐(80 cm×40 cm×40 cm)中。塑料筐中间用1块塑料挡板隔开，平均分为2个部分，因此每个塑料筐可放养2只试验蟹，每个部分放置2个相同的塑料盒(25 cm×15 cm×10 cm)，一个装2/3的沙子用作三疣梭子蟹的栖息场所，另一个用作投料台。试验以60只试验蟹为1组，养殖于30个塑料筐中，每组设3个重复，每个重复10个塑料筐(共20只试验蟹)，每个重复的10个筐紧挨在一起排成一列。所有的塑料筐放置在同一水泥池(70 m×80 m×0.6 m)中，为了减少外界环境因素的干扰，每个重复随机放置于水泥池的不同位置。每天投喂1次，日投喂量为其体重的6%～8%，投喂时间为17:00，第2天早晨检查摄食情况并捞取残饵，以调整其投饵量，尽量让饲料在60 m in内被试验蟹摄食完，后期的投喂量为体重的3%～5%。因养殖采取单体框养，养殖工作量较大且投喂量会根据摄食情况进行调整，每天残饵量很少或几乎没有，因此没有对残饵进行收集处理。养殖过程中每天换水。试验用水采用沙滤的天然海水，试验期间不间断充气，试验水温为 26～28℃，溶解氧浓度为 6.5～7.0 mg/m L，pH 为 7.5 ～ 7.8，盐度为 26‰ ～ 28‰，养殖试验持续8周。

1.3 样品采集和分析方法

试验结束时饥饿24 h，逐个称重并记录个数。每组随机取2～3只蟹，保存于－20℃冰箱，用于全蟹常规营养成分分析，分析方法参照AOAC(1995)［27］。水分含量采用105℃常压干燥法测定;粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(总氮×6.25)测定;粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，提取有机试剂为石油醚;粗灰分含量采用550℃高温炉灼烧法测定。

每组取5～6只蟹，用剪子剪出肌肉，保存于－20℃冰箱，其中小部分用以分析肌肉的氨基酸组成，分析采用日立L－8900氨基酸自动分析仪，参照文献［28］的方法进行。其余剩余肌肉用于常规营养成分分析，分析方法同全蟹常规营养成分分析方法。

蛋氨酸溶失率测定参照 Cruz-Suárez等［29］的方法。随机选择1组饲料，称取5 g置于盛有500 m L养殖试验海水的烧杯中，分别浸泡30、60和120 m in取出烘干称重，粉碎测其蛋氨酸含量。

1.4 计算公式

增重率(WGR，%)=100×

(终末均重－初始均重)/初始均重;

特定生长率(SGR，%/d)=100×

(ln终末均重－ln初始均重)/试验天数;

成活率(%)=100×终末存活蟹个数/

初始存活蟹个数;

饲料效率(FE)=(终末蟹总重+死亡蟹

总重－初始蟹总重)/摄食量;

蛋白质效率(PER，%)=100×蟹体净增重/

(饲料摄入量×饲料粗蛋白质含量)

蛋白质沉积率(PPV，%)=100×(终末体重×

终末蟹粗蛋白质含量－初始体重×初始蟹

粗蛋白质含量)/(饲料摄入量×饲料

粗蛋白质含量)。

1.5 统计分析方法

试验数据采用平均值±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0统计软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著时采用Duncan氏法对各组间数据进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 饲料中蛋氨酸含量对三疣梭子蟹幼蟹生长指标的影响

由表3可知，饲料中蛋氨酸含量对成活率没有显著影响(P＞0.05)，但是对体增长指标WGR、SGR以及饲料利用指标FE、PPV和PER影响显著(P＜0.05)。当饲料中蛋氨酸含量由0.61%增加到0.97%，WGR 和 SGR 显著提高(P＜0.05);当饲料中蛋氨酸含量由 0.97%增加到 1.44%，WGR和SGR无显著差异(P＞0.05);当饲料中蛋氨酸含量由1.44%增加到1.64%，WGR和SGR反而显著下降(P＜0.05)。PPV、FE 和 PER 与 WGR、SGR 呈基本相同的变化趋势。以SGR为评价指标，通过折线模型得出三疣梭子蟹幼蟹对饲料中蛋氨酸的需要量为 1.07%(图 1)，占饲料蛋白质的 2.16%(当饲料半胱氨酸含量在 0.42%～0.47%时)。因晶体氨基酸在水中会有溶失，因此本试验选择了其中一组饲料进行了蛋氨酸溶失率的测定，饲料中蛋氨酸溶失率结果见表 4，浸泡 30、60和120 m in后蛋氨酸的溶失率分别为 4.77%、10.21%和17.52%。而根据养殖的实际情况，三疣梭子蟹是在60 m in内摄食完，因此，考虑溶失率，本试验条件下，三疣梭子蟹幼蟹对饲料中蛋氨酸的需要量为0.96%，占饲料蛋白质的1.94%。

表3 饲喂不同蛋氨酸含量饲料的三疣梭子蟹幼蟹的生长指标Table 3 Grow th indices of juvenile sw imm ing crab fed diets containing different contents of Met(n=3)

2.2 饲料中蛋氨酸含量对三疣梭子蟹幼蟹全蟹及肌肉成分的影响

由表5可知，饲料中蛋氨酸含量对三疣梭子蟹全蟹及肌肉常规营养成分均无显著影响(P＞0.05)。

2.3 饲料中蛋氨酸含量对三疣梭子蟹幼蟹肌肉氨基酸组成的影响

由表6可知，肌肉氨基酸组成不受饲料中蛋氨酸含量的显著影响(P＞0.05);各组肌肉必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(ΣEAA/ΣNEAA)为0.77～0.80。

3 讨论

本试验结果表明，饲料中蛋氨酸含量影响三疣梭子蟹的生长性能，在本研究中，当饲料中蛋氨酸含量为0.61%～1.94%时，各组的 WGR和 SGR表现为先增加后降低的变化趋势，这与军曹鱼［11］、印 度 鲮 (Cirrhinus mrigala)［30］和 大 黄 鱼(Pseudosciaenacrocea)［31］的研究结果相一致。饲料中蛋氨酸含量过低会导致生长缓慢以及饲料利用率过低，而摄取高含量蛋氨酸饲料也会导致动物生长缓慢［1］。本试验以SGR为指标，通过折线回归模型得出三疣梭子蟹幼蟹饲料中蛋氨酸的最适含量为1.07%，占饲料蛋白质的2.16%，若考虑本试验饲料在水中的溶失，以浸泡60 m in后的溶失率换算，则其对蛋氨酸的需要量为0.96%，占饲料蛋白质的1.94%。

图1 饲料蛋氨酸含量与三疣梭子蟹幼蟹特定生长率的关系Fig.1 Relationship between dietary Met content and SGR of juvenile sw imm ing crab

表4 在海水中浸泡不同时间饲料中蛋氨酸的溶失率(干物质基础)Table 4 Diratey Met dissolve-loss rate immersed in seawater w ith differentm inutes(DM basis) %

表5 饲喂不同蛋氨酸含量饲料的三疣梭子蟹幼蟹的全蟹及肌肉常规营养成分(湿重基础)Tab 5 Common nutrient composition in whole body and muscle of juvenile sw imm ing crab fed diets containing different contents of Met(wetweight basis，n=3)

在水产动物中关于蛋氨酸需要量的报道多见于鱼类中，已有的研究结果表明鱼类对蛋氨酸的需要量为饲料蛋白质的 1.3% ～ 3.3%［8－12，32－44］。本试验确定三疣梭子蟹幼蟹蛋氨酸需要量为饲料蛋白质含量 2.16%，与凡纳滨对虾(2.16%)［17］和大西洋沟虾(2.0%～2.4%)［13］的研究结果相似，但高于日本对虾(1.4%)［14］，低于斑节对虾(2.4%［15］或 2.9%［16］)和中华绒螯蟹(2.95%)［18］的研究结果。从以上研究结果可以看出，不同的水产动物之间对饲料中蛋氨酸的需要量差异较大，甚至在同一品种间也会存在较大的差异，这可能是由饲养条件及养殖模式的不同、饲料原料及氨基酸组成不同所引起的［31，33］;此外，当饲料中半胱氨酸供应不足时，蛋氨酸会转变成胱氨酸来满足动物对半胱氨酸的需要，反之当饲料中半胱氨酸足够时，有节约蛋氨酸的作用，因此这也会导致得到的研究结果差异较大［1］，本试验饲料配方中半胱氨酸含量在0.42%～0.47%之间。有研究表明，外界的环境因素，如水温、水流及养殖密度等也会引起鱼类和甲壳类对营养需求评估的差异［45］。还有一些研究显示氨基酸的需要量可能与饲料蛋白质含量密切相关，因此不同的饲料蛋白质含量对氨基酸需要量的确定也有影响［46－48］。目前关于饲料氨基酸营养对三疣梭子蟹影响的研究尚处于空白，也未有蛋氨酸和半胱氨酸在三疣梭子蟹体内转化作用的报道，今后需进一步开展研究确定和完善。

表6 饲喂不同蛋氨酸含量饲料的三疣梭子蟹幼蟹的肌肉氨基酸组成Table 6 Am ino acid composition ofmuscle of juvenile sw imm ing crab fed diets containing different contents of Met(n=3)

饲料中蛋氨酸含量影响了三疣梭子蟹幼蟹对饲料的利用，FE、PER和PPV的最高值出现在蛋氨酸含量为1.44%组，但与蛋氨酸含量为0.97%和1.18%组之间并无显著差异，这和生长结果较类似。在本试验中，FE、PER和PPV均表现为先上升后下降的趋势，当饲料中蛋氨酸含量为0.61%时，FE、PER和PPV都表现为最低，若适当增加蛋氨酸含量，可以显著提高FE、PER和PPV，这表明适量的蛋氨酸含量可以提高三疣梭子蟹幼蟹的FE、PER及PPV，而过低或过高的蛋氨酸含量反而获得较低的FE、PER和PPV，类似的结果在石斑鱼 (Palaemonetes varians)［38］、岩 鱼 (Sebastes schlegeli)［39］、军曹鱼［11］和印度鲮［30］中也均有报道，这可能是因为适宜的蛋氨酸含量使氨基酸池达到平衡，生理各项吸收和代谢功能等达到最佳状态，而使FE、PER和PPV都高于含量过低或过高组。

饲料中蛋氨酸含量对三疣梭子蟹全蟹以及肌肉的常规营养成分影响不显著。在凡纳滨对虾的研究中显示除肌肉中的粗脂肪含量外，饲料中蛋氨酸含量对凡纳滨对虾全虾及肌肉的常规营养成分均无显著影响［17］;在石斑鱼的研究中表明饲料中蛋氨酸含量对肌肉中粗灰分含量无显著影响［38］;在黑鲷(Sparusmacrocephalus)的研究中得出饲料中蛋氨酸含量对全鱼的粗脂肪、粗灰分以及水分含量均无显著影响，对肌肉中粗灰分及水分也无显著影响［49］。但也有研究表明饲料中蛋氨酸含量对体成分有显著影响，这在岩鱼［39］、印度鲮［30］、北极红点鲑(Salvelinus alpinus)［35］和黄

鱼(Seriolaquin oueradiata)［40］中均有报道。有研究提出氨基酸含量的不平衡会导致机体蛋白质合成降低［50］，本试验中蟹体及肌肉粗蛋白质含量各组间无显著差异，这可能是因为本试验的基础饲料中即使是添加低水平的蛋氨酸也尚不足以影响其他氨基酸的合成和代谢，所以对蟹体及肌肉粗蛋白质含量无显著影响;而摄入高含量蛋氨酸饲料的组，蟹体及肌肉蛋粗白质含量却并没有显著高于其他组，可能是由于摄入的过多的蛋氨酸除了参与蛋白质合成也参与了其他的营养物质的合成代谢［4－5］，对此今后还需要更深入地探究。

许多研究表明，肌肉、血液或其他组织中必需氨基酸的含量可以用来衡量饲料中氨基酸组成的状态［51－53］。在本试验也对肌肉组织进行了氨基酸组成分析，结果得出三疣梭子蟹幼蟹肌肉中必需氨基酸和非必需氨基酸含量以及二者比值均不受饲料中蛋氨酸含量的显著影响。对大黄鱼的研究表明饲料中蛋氨酸含量会显著影响肌肉中蛋氨酸和异亮氨酸的含量，但不影响其他氨基酸含量［31］;对石斑鱼的研究表明饲料中蛋氨酸含量对肌肉中的各必需氨基酸含量均有显著影响［38］。本研究中各组肌肉氨基酸含量之间无显著差异可能是因为基础饲料中各氨基酸含量较为均衡，设计的蛋氨酸含量梯度也不足以影响肌肉中氨基酸组成，此结果也与肌肉常规营养成分分析结果相互印证。

4 结 论

在本试验条件下，以SGR为评价指标，通用折线回归模型得出三疣梭子蟹幼蟹对饲料中蛋氨酸的需要量为1.07%，占饲料蛋白质的2.16%。若考虑到晶体氨基酸在水中的溶失，则三疣梭子蟹幼蟹对饲料中蛋氨酸的需要量为0.96%，占饲料蛋白质的1.94%(以蛋氨酸在海水中浸泡60 m in后的溶失率10.21%换算)。

致谢:

感谢宁波大学海洋学院鱼类营养研究室全体成员对本试验提供的支持和帮助，感谢象山鑫亿鲜活水产有限公司提供试验场所和养殖系统，才能使本试验顺利进行。

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