电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后的再生促进作用及对IGF-1表达的影响

彭园园 张莉 刘通 陈玉佩 葛东宇 毛颖秋



·论著·

电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后的再生促进作用及对IGF-1表达的影响

彭园园 张莉 刘通 陈玉佩 葛东宇 毛颖秋

目的 观察电针委中穴对腰部多裂肌损伤后的干预作用及对胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)表达的影响，探求委中穴对大鼠腰肌损伤后再生修复的可能机制。方法 雄性SD大鼠120只，随机分为空白组、模型对照组、模型组、电针委中组、电针肾俞组，共5组，观察3个时间点(4天、7天、14天)的变化，每个时间点8个样本。 将0.5%布比卡因盐酸盐溶液按每点100 μL注射于模型组和电针组大鼠L4、L5水平的多裂肌上。模型对照组采用同样方法注射生理盐水，空白组不做处理。造模后进行电针双侧委中穴或肾俞穴分别治疗4天、7天、14天，HE染色观察肌细胞形态学的改变，免疫组化方法检测肌细胞IGF-1的表达。结果 造模前后多裂肌形态学改变显著，损伤后第14天仍未完全恢复。电针委中组与电针肾俞组从形态学上优于模型组。第4、7天模型组多裂肌IGF-1的表达显著高于空白组(P<0.01)；第4天电针委中组表达显著高于模型组(P<0.01)，电针委中组表达高于电针肾俞组(P<0.05)，电针肾俞组表达高于模型组(P<0.05)，而在第14天，电针肾俞组表达显著高于模型组与电针委中组(P<0.01)。结论 电针委中穴和电针肾俞穴均能够促进大鼠腰多裂肌损伤后的再生，电针委中穴在肌肉损伤的早期效果显著。

电针； 多裂肌损伤； 布比卡因； 委中； 肾俞； 胰岛素样生长因子1

位于腰部竖脊肌深面的多裂肌是稳定腰椎的“钢索”。以多裂肌为代表的腰部骨骼肌功能紊乱或损伤可导致各种急慢性腰痛[1-2]。研究表明，急性或慢性腰痛患者其多裂肌的I型和II型纤维会发生异常改变并伴有脂肪浸润或出现多裂肌的萎缩。L4、L5节段的多裂肌对脊柱的稳定性贡献最高，达70%以上[3]。因此，多裂肌损伤后的修复尤为重要。四总穴歌中的“腰背委中求”是委中穴治疗腰背部疾病存在独特疗效的临床经验总结，也体现了“经脉所过，主治所及”的取穴原则。胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)可以促进肌卫星细胞的增殖，并且选择性的表达生肌调节因子。IGF-1是目前确定的唯一一种既参与肌卫星细胞的增殖又参与肌母细胞分化的生长因子[4]。前期实验证明电针委中穴能够促进兔腰肌急性钝挫伤后碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、结蛋白(desmin)以及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的表达[5]。说明委中穴对腰肌急性钝挫伤有促进再生修复的作用。本实验进一步观察电针委中穴对布比卡因所致大鼠腰多裂肌毒性损伤后的再生修复作用及对IGF-1表达的影响，进一步探求委中穴对腰部肌肉损伤后再生修复的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠120只，体重300～350 g。由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001。分笼饲养，明暗周期12小时，自由饮食和饮水，环境温度24℃，湿度40～50%，适应性饲养7天。大鼠按体重分层，随机分为：空白组、模型对照组、模型组、电针委中组和电针肾俞组各24只，再随机分为三个时间点4天、7天、14天，每组各8只。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 仪器 G6805-1电针治疗仪(青岛鑫升实业有限公司)； RM2235石蜡切片机(德国LEICA公司)； DH-101电热恒温鼓风干燥箱(北京利康科技发展有限公司)；BX43显微镜(日本OLYMPUS公司)； Mshot MC50显微成像系统(广州市明美科技有限公司)。

1.2.2 试剂 布比卡因盐酸盐(美国sigma-FLUKA公司，生产批号：B5274-1G)；IGF-1抗体(美国millipore公司，生产批号：05-172)；小鼠超敏二步法检测试剂盒(中杉金桥，生产批号：PV-9002)。

1.3 模型的建立和处理方法

1.3.1 造模 模型组和电针组大鼠10%水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg)麻醉后，选择双侧脊柱L4、L5水平两旁的4个点，使用一次性4号针头注射器抽取0.5%布比卡因溶液，针头紧贴棘突旁进入肌肉，直到接触关节突和乳突所在的骨面回抽套管1mm无血，表明针头已到达多裂肌后注射布比卡因溶液400 μL(100 μL×4)，时间不得小于3秒，以利于药物的吸收[6]，单次造模完成。模型对照组采用同样办法注射生理盐水。

1.3.2 处理方法 电针委中组和电针肾俞组从造模后的第2天开始干预，将大鼠固定在特制的固定器上，分别暴露后肢和背部。采用华佗牌0.30×13 mm一次性针灸针，直刺进针后连接电针仪，频率2/10 Hz 疏密波，电流1～2 mA，持续20分钟，每天1 次，直至取材前1天。参照《实验针灸学》[7]常用实验动物穴位图谱，分别选取双侧“委中穴”(膝关节背面正中)和双侧“肾俞穴”(第2腰椎旁开7 mm)。

1.4 取材

分别在造模后的第4天、7天、14天每组同步取材8只。10%水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg)麻醉后，剔除背部皮毛、筋膜，充分暴露腰部肌肉，剥离开最长肌和髂肋肌，锐性切取L4和L5水平多裂肌组织，置4%多聚甲醛溶液中固定。

1.5 指标检测

1.5.1 HE染色 4%多聚甲醛溶液固定48小时以上，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察形态学变化。

1.5.2 免疫组化染色 将切片60℃ 烤片2小时，常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，热修复抗原，PBS冲洗，过氧化氢封闭10分钟，滴加一抗，4℃孵育16小时，加二抗，DAB显色，显微镜下观察，出现棕黄色后即把切片放入自来水冲洗终止反应。脱水透明，中性树胶封片。利用无偏体视学技术，光镜下(400×)全视野无偏采样方法每张切片选取3个视野，采用image-professional plus 6.0软件进行图像分析，测量每个视野中IGF-1阳性表达区域的平均光密度值(mean optical density，MOD)，取平均值为该样本MOD值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 组织形态学变化

如图1 所示：空白组和模型对照组多裂肌HE染色：肌细胞呈细长纤维状，排列整齐，细胞核均匀的分布在细胞周围。模型组：造模后第4天可见肌纤维广泛变性坏死，此时，大部分坏死的肌纤维已被巨噬细胞吞噬，坏死区可偶见散在的未受损纤维束，电针委中组和电针肾俞组可见少量的新生幼稚纤维。至第7天，出现更多的新生红色肌纤维，且直径变大；委中组较肾俞组可见较多的红色新生条状纤维。至第14天，新生的肌纤维已接近正常肌纤维的形态，平行排列，部分中央核开始向细胞周围迁移分化为成熟的肌纤维。由图可见，在同一时间内，电针委中组与电针肾俞组的肌纤维再生程度优于模型组，尤其是电针委中组。从形态学上说明电针委中/肾俞可加快肌细胞的再生。

2.2 免疫组化IGF-1的表达

如图2 所示：空白组与模型对照组IGF-1几乎无表达，略高于背景，分布较均匀。造模后第4天各组均可见IGF-1强阳性表达，从图2(D)可见左侧未损伤肌细胞(uninjured muscle, UM)着色浅，右侧损伤肌细胞(injured muscle，IM)着色深。造模后7天，IGF-1仍然呈阳性表达，肾俞组略高于模型组合委中组。造模后14天，IGF-1阳性表达减少。

图像分析显示，第4天、7天模型组多裂肌IGF-1的表达显著高于空白组(P<0.01)。第4天电针委中组表达显著高于模型组(P<0.01)，电针委中组表达高于电针肾俞组(P<0.05)，电针肾俞组高于模型组(P<0.05)。第7天，模型组、电针委中组、电针肾俞组之间均无统计学意义，但肾俞组已表现出高于其他两组的趋势。第14天，电针肾俞组表达显著高于模型组与电针委中组(P<0.01)，见表1。

A：正常组；B：模型对照组；C：模型组4d；D：电针委中组4d；E：电针肾俞组4d；F：模型组7d；G：电针委中组7d；H：电针肾俞组7d；I：模型组14d；J：电针委中组14d；K：电针肾俞组14d图1 不同时间点各组大鼠腰部多裂肌HE染色

A：正常组；B：模型对照组；C：模型组4d；D：电针委中组4d；E：电针肾俞组4d；F：模型组7d；G：电针委中组7d；H：电针肾俞组7d；I：模型组14d；J：电针委中组14d；K：电针肾俞组14d。 UM：未受损纤维；IM：受损纤维。图2 不同时间点各组大鼠腰多裂肌IGF-1的表达

组别4d7d14d空白组(n=8)0.019±0.0070.017±0.0090.020±0.003模型对照组(n=8)0.022±0.0050.021±0.0080.015±0.005模型组(n=8)0.158±0.061b0.089±0.021b0.039±0.030a电针委中组(n=8)0.263±0.047bde0.092±0.029b0.043±0.025b电针肾俞组(n=8)0.203±0.027bc0.107±0.015b0.079±0.010bdf

注：与空白组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，dP<0.01；与电针肾俞组比较，eP<0.05；与电针委中组比较，fP<0.01。

3 讨论

全球约9.2%的人群受腰痛影响[8]，其中90%的腰痛患者为非特异性腰痛[9]，椎间盘源性腰痛占非特异性腰痛中绝大多数。脊柱及椎间盘的不稳定是导致间盘源性腰痛的主要因素，而多裂肌是稳定脊柱的重要肌群。临床研究中发现很多急慢性腰痛患者均存在多裂肌功能异常或萎缩或伴有脂肪浸润[3-5]。因此多裂肌损伤后的再生修复非常关键。胰岛素生长因子(insulin-like growth factors ，IGFs)是肌肉再生和分化的关键生长因子。IGF-1可以促进肌卫星细胞的增殖，并且选择性的表达生肌调节因子。布比卡因引起肌肉损伤后，在修复的初期伴随IGF-1的自分泌并且调控MyoD的表达和肌卫星细胞的激活[10]。因此，IGF-1在肌肉再生中发挥非常重要的作用。

针刺在治疗运动系统疾病疗效肯定，也是国内外针刺研究者的主要研究方向之一。电针疗法是针刺治疗骨骼肌损伤研究中最常用的一种干预方法。临床和实验室研究表明，电针在治疗骨骼肌损伤能通过多种途径取得疗效[11-15]。委中穴是治疗腰背部疾患的通用穴，它被高频次的应用于临床[16-17]，或是单穴应用或是众穴协同均效验，“腰背委中求”是委中穴治疗腰背部疾病存在独特疗效的临床经验总结。肾俞穴是治疗腰部疾病的另一常用穴[18]，腰为肾之府，又为局部取穴，可疏通局部气血。本研究结果显示，布比卡因引起多裂肌损伤后会使得IGF-1表达上调，电针委中穴和电针肾俞穴均能使IGF-1的表达增加。值得提出的是，在损伤早期(第4天)电针委中组IGF-1的表达高于电针肾俞组。随后两组IGF-1的表达均下降，但仍高于模型组。至第7天时两组表达无差异，甚至出现肾俞组高于委中组的趋势，到损伤的中后期时(第14天)电针肾俞组的表达却显著高于委中组。说明电针委中穴可在肌肉损伤的早期起到较好的作用，肾俞穴在肌肉再生的中后期仍然有效。即委中穴起效快而肾俞穴作用更持久。从形态学恢复上亦是如此。

委中穴治疗腰背痛多以急性为主如急性腰扭伤、脊柱强直、坐骨神经痛、腰椎间盘突出症等，另外亦可治疗、高热抽搐、急性吐泻等急症[19]。也有研究表明针刺或刮痧委中穴可使同侧腰部膀胱经皮肤血流量即刻升高[20-21]。而肾俞穴多以治疗慢性疾病为主如慢性腰肌劳损，肾虚腰痛、慢性疲劳综合征等[22]。由此可见，本实验研究结果与中医传统理论以及临床实践具有一致性。

布比卡因引起的骨骼肌损伤初期伴有IGF-1的表达并激活肌卫星细胞进行增殖分化，从而进行骨骼肌的再生。电针委中穴能够明显改善大鼠腰多裂肌损伤后的组织形态学变化并增加生长因子IGF-1的表达，尤其是在肌肉损伤的早期，其作用优于电针肾俞组。

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(本文编辑：韩虹娟)

Effect of electroacupuncture at BL40 on morphology repairment and IGF-1 expression in rats with multifidus muscle injury

PENGYuan-yuan,ZHANGLi,LIUTong,etal.

SchoolofAcupunture-moxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

ZHANGLi,E-mail:zhangli1572@sina.com

Objective To observe the effect of electroacupuncture on multifidus musle injury by morphological observation and insulin like growth factor 1(IGF-1) expression of rats with bupivacaine induced multifidus muscle toxicity, and discuss the possible mechanism of muscle tissue regeneration. Methods 120 male Sprague Dawley rats were randomly divided into blank group (BG), model control group(CG), model group (MG),Weizhong(BL40) electroacupuncture group (WG) andShenshu(BL23) electro-acupuncture group (SG), each group then was divided evenly into three time points (day4, day7 and day14) and each time point has 8 samples. Multifidus muscle (L4 and L5 sections) toxicity was established by injecting 0.5% bupivacaine hydrochloride, and normal saline injection as control (CG). The WG and LG accepted electro-acupuncture for 4d, 7d or 14d after modeling. The multifidus muscle of each rodent was stained with HE to observe pathological changes, and immune-histochemical staining was used to observe IGF-1 expression. Results Bupivacaine caused a process of degeneration-regeneration of the muscle fibers and did not normalize at day 14. WG and SG were recovered faster than MG. The expression of IGF-1 at day 4 ranked as MG higher than BG (P<0.01), WG higher than MG and SG (P<0.01,P<0.05), and SG higher than MG (P<0.05), while ranked as SG higher than MG and WG (P<0.01) at day14. Conclusion Electro-acupuncture at both BL40 and BL23 could promote the regeneration of tissue after multifidus muscle injury, and it seems better therapy effect when electro-acupuncture at BL40.

Electro-acupuncture;Multifidus muscle injury;Bupivacaine;BL40; BL23;IGF-1

国家自然科学基金(81141120)

100029，北京中医药大学针灸推拿学院[彭园园(硕士研究生)、张莉、刘通(博士研究生)、陈玉佩(硕士研究生)]，基础医学院(葛东宇)，科研实验中心(毛颖秋)

彭园园(1988- )，女，2012级在读硕士研究生。研究方向：针灸临床机理研究。E-mail：175808605@qq.com

张莉(1957- )，女，博士，博士生导师，教授。研究方向：针灸临床机理研究。E-mail：zhangli1572@sina.com

R245

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.05.001

2014-12-18)