华蟾素抗肺癌细胞的实验研究

盛 凯，惠萍萍，陆佳欢

(1.上海同济大学医学院,上海 200092;2.上海市同仁医院消化科 200332)



·论 著·

华蟾素抗肺癌细胞的实验研究

盛 凯1，惠萍萍2△，陆佳欢2

(1.上海同济大学医学院,上海 200092;2.上海市同仁医院消化科 200332)

目的 探究华蟾素的抗肺癌活性。方法 培养肺癌A549细胞，对华蟾素、环孢素-A(CsA)、萨菲菌素A(SfA)作用于肺癌A549细胞后的细胞存活率、细胞死亡率、细胞凋亡率以及线粒体膜电位(MMP)进行检测；建立小鼠移植瘤模型，对华蟾素作用于小鼠移植瘤模型后的肿瘤体积以及小鼠存活率进行检测，并整理数据进行统计学对比分析。结果 通过小鼠移植瘤模型，该研究发现华蟾素抑制了A549肺癌细胞在体内生长。研究结果表明亲环蛋白D(Cyp-D)依赖的线粒体通透性转换孔(mPTP)开放可调节由华蟾素诱导的肺癌细胞的非凋亡性死亡。Cyp-D的抑制剂环孢素-A(CsA)，mPTP的阻断剂萨菲菌素A(SfA)极明显地阻碍了由华蟾素诱导的线粒体膜电位(MMP)的下降和A549细胞的死亡(非凋亡)。结论 华蟾素可以诱导肺癌细胞死亡，值得进一步研究，有望成为一种新型的抗肺癌药物。

肺癌； 华蟾素； 亲环蛋白D; 线粒体通透性转换孔; 细胞死亡

华蟾素是一种强心甾类固醇或蟾蜍二烯羟酸内酯，提取于传统中药蟾蜍皮肤表面分泌的油脂[1-2]。华蟾素可用作强心剂、利尿剂和止血剂应用于临床。尽管很多研究都表明，多种癌细胞中的蟾蜍二烯羟酸内酯(如蟾蜍灵)有抗肿瘤活性和增强化疗效果的特性[3]，但华蟾素潜在的抗肿瘤活性还未得到广泛研究，且关于其内在机制的探讨尚浅。线粒体通透性转换孔(mPTP)在细胞死亡中扮演着关键的角色[4]。mPTP是一个通道复合体，由外膜中的电压依赖性阴离子通道(VDAC)、内膜中的腺嘌呤核苷酸转运体(ANT)和线粒体基质中的亲环蛋白D(Cyp-D)构成[5-6]。通过细胞毒素的刺激，Cyp-D和内膜中的ANT联合，促进mPTP开放，从而导致线粒体去极化、线粒体肿胀和钙的释放，最终导致细胞死亡。本研究发现Cyp-D和mPTP是华蟾素诱导肺癌细胞死亡的重要调节者因素。故设计本实验，对华蟾素抗肿瘤活性进一步研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 A549、H460、HTB-58及HEK-293人肺癌细胞系购自上海中国医学科学院细胞库。

1.2 仪器与试剂 华蟾素、萨菲菌素A(SfA)和环孢霉素A(CsA)由美国Sigma公司制备；Z-VAD-fmk(ZVAD)购自上海Calbiochem公司；Cyp-D抗体和微管蛋白购自美国Santa Cruz生物制药公司。培养基为含10%胎牛血清(FBS，购自上海Hyclone公司)的DMEM，加入抗生素，在37 ℃，体积分数为5%的CO2温育箱中培养。

1.3 方法

1.3.1 细胞存活率检测 用四唑染色法(MTT法)检测细胞存活率。将细胞接种于96孔板中处理，每孔中加入5 mg/mL的MTT(溶于磷酸缓冲液PBS)，然后培养3 h。待介质通气后，每孔中加入150 μL的DMEM。轻摇孔板至呈色反应均匀，且酶标仪测出OD值为OD 490。只由介质处理的细胞存活率为100%，细胞存活率=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.3.2 细胞死亡率检测 细胞经过处理后，再计量死亡细胞数(用台盼蓝染色，死细胞呈蓝色阳性反应)。细胞死亡率=经台盼蓝染色后呈蓝色阳性反应的细胞数/总细胞数×100%。细胞总数由细胞计数器自动记录。

1.3.3 细胞凋亡率检测 将细胞接种于6孔板中，当细胞生长至70%～80%时进行实验。每孔加入被测试剂，培养至指定时间点。用Trypsin-EDTA消化法收集细胞。在70%冷乙醇固定细胞后，在37 ℃下，用5 mg/mL碘化丙啶(PI)和1 mg/mL Annexin V将细胞染色30 min。之后在流式细胞仪上对样本进行检测，每个样本中含10 000个细胞。Annexin V 百分比反应细胞凋亡率。Annexin V 阳性、PI阴性以及Annexin V 阳性、PI阳性的细胞合为凋亡细胞。

1.3.4 MMP的检测 用JC-1染色法测量MMP。JC-1染料聚集在线粒体膜内，在正常静息细胞中发出橘色荧光。当膜电位降低时，JC-1单体在胞液内形成，发出绿色荧光。因此，通过检测绿色荧光强度来检测MMP的降低程度[7]。简而言之，经过处理后，在黑暗中，用5.0 μg/mL JC-1染色A549细胞。用温和的PBS冲洗细胞两次，在新鲜的培养基中再次悬浮细胞，再立即用含485 nm感光滤光片的酶标仪读取OD数值。试验组的OD数值规范化为介质对照组的OD数值。

在接受1 μmol/L华蟾素刺激之前，先将A549细胞用0.1 μmol/L CsA或 SfA培育1 h，再分别用MTT法和台盼蓝染色法分析细胞活性和凋亡情况。用JC-1染色法检测MMP降低情况。用1 μmol/L华蟾素刺激A549细胞内scramble shRNA、Cyp-D shRNA-1及Cyp-D shRNA-2的稳定表达。用1 μmol/L华蟾素或含0.1 μmol/L CsA的华蟾素处理HEK-293细胞表达对照组或0.5 μg/每孔的Cyp-D载体72 h。

1.3.5 动物 公裸鼠4～6周大，为BALB/c小鼠，购自上海中国医学科学院实验动物研究所。所有试验根据作者所隶属的实验动物研究委员会之实验动物护理和使用指南实施。

1.3.6 肺癌A549裸鼠移植瘤模型 如先前研究所述，公裸鼠被用来建立肺癌A549移植瘤模型。在小鼠的右股皮下注射A549细胞(0.1 mL培养基中含500万个细胞)，当肿瘤达到200～300 mm的平均量时进行实验。将22～25 g、6～8周大的裸公鼠贴上耳标，小鼠被随机分为3组，每组含10只小鼠，每组分别加入：(1)载体；(2)1.0 mg/kg华蟾素；(3)5.0 mg/kg华蟾素。再在皮下接种0.1 mL培养基中的2 ×106个A549细胞。接种6 d后开始实验。小鼠腹腔注射华蟾素，每天2次，连用1周。每天对小鼠进行检查，确定与实验相关的不良反应和死亡率。用卡尺测量肿瘤体积，每周1次，连测5周。在第5周时，也要测量小鼠的体质量和存活率。肿瘤体积(按mm3计)按以下公式计算：体积=(短径2×长径)/2。

2 结 果

2.1 不同浓度华蟾素诱导肺癌细胞的毒性作用 0.1 μmol/L的华蟾素作用于A549细胞72 h后，测出的细胞存活率、细胞死亡率以及细胞凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；0.5 μmol/L的华蟾素的细胞存活率低于对照组，细胞死亡率以及细胞凋亡率高于对照组，各项指标与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 华蟾素对肺癌细胞A549的毒性作用与Cyp-D抑制剂CsA和mPTP阻断剂SfA的关系 华蟾素诱导经CsA和SfA处理过的肺癌细胞A549后，细胞存活率均低于对照组，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，细胞死亡率均高于对照组，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，MMP降低均高于对照组，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 不同浓度华蟾素作用于A549细胞后的结果

注：Ct代表介质处理的对照组，与对照组比较，*P<0.05。

表2 华蟾素作用于经CsA和SfA处理后肺癌细胞A549的结果

注：Ct代表介质处理的对照组，与对照组比较，*P<0.05。

2.3 华蟾素抑制活体内肺癌A549细胞的生长 用小鼠肺癌A549细胞移植瘤模型检测体内华蟾素的抗癌活性，使用1、5 mg/kg华蟾素，第5周时小鼠体内的肿瘤体积小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且5 mg/kg组小于1 mg/kg组，见图1。使用1、5 mg/kg华蟾素的肿瘤小鼠第5周存活率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且5 mg/kg组高于1 mg/kg组，见图2。

图1 不同时间不同浓度华蟾素作用于肿瘤模型小鼠后的肿瘤体积

图2 不同浓度华蟾素作用于肿瘤模型小鼠5周后小鼠的存活率

3 讨 论

长期以来，细胞坏死性死亡被认为是非程序性的，但最近细胞坏死被证明和细胞凋亡一样，也是一个程序化过程。与缺血再灌注损伤、氧化应激、化疗药物和紫外线诱导细胞死亡一样，程序性细胞坏死也是导致细胞死亡的重要原因[8-9]。有研究表明，阿霉素诱导细胞死亡主要是因为细胞程序性坏死，而不是细胞凋亡。另有研究显示，Cyp-D及其调节的mPTP开放可能在细胞程序性坏死过程中扮演着重要角色。大部分研究提示，Cyp-D转移到线粒体内膜后，和线粒体内膜中蛋白质ANT形成复合体，指导mPTP开放，导致线粒体去极化，最终导致细胞坏死。

所以作者在前期通过华蟾素诱导肺癌细胞产生毒性作用后，测试了Cyp-D对华蟾素诱导肺癌细胞产生毒性作用的重要性。本研究结果显示Cyp-D抑制剂CsA和mPTP阻断剂SfA严重抑制了Dox诱导的A549细胞活性的降低和死亡，华蟾素诱导的细胞毒作用受到了CsA和SfA的阻碍。而且华蟾素降低了A549细胞中的MMP，使mPTP得到开放。以上结果表明，Cyp-D能调节由华蟾素诱导的mPTP开放和随后肺癌细胞的非凋亡性死亡。所以华蟾素很有可能成为一种新型抗肺癌药物，但仍需进一步研究证实。

[1]Son MB,Gauvreau K,Burns JC,et al.Infliximab for intravenous immunoglobulin resistance in Kawasaki disease: a retrospective study[J].J Pediatr,2011,158(4):644-649.

[2]Emam H,Zhao QL,Furusawa Y,et al.Apoptotic cell death by the novelnatural compound,cinobufotalin[J].Chem Biol Interact,2012,199(3):154-160.

[3]Yin PH,Liu X,Qiu YY,et al.Anti-tumor activity and apoptosis-regulation mechanisms ofbufalin in various cancers: new hope for cancer patients[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(11):5339-5343.

[4]Javadov S,Kuznetsov A.Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilind[J].Front Physiol,2013,11(4):76.

[5]Lu JH,Shi ZF,Xu H.The mitochondrial cyclophilin D/p53 complexation mediates doxorubicin-inducednon-apoptotic death of A549 lung cancer cells[J].Mol Cell Biochem,2014,389(1/2):17-24.

[6]Zhen YF,Wang GD,Zhu LQ,et al.P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts[J].J Cell Physiol,2014,229(10):1475-1783.

[7]Vaseva AV,Marchenko ND,Ji K,et al.p53 opens the mitochondrial permeability transition pore to trigger necrosis[J].Cell,2012,149(7):1536-1548.

[8]Chen B.Cisplatin-induced non-apoptotic death of pancreatic cancer cells requires mitochondrial cyclophilin-D-p53 signaling[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,437(4):526-531.

[9]Ji C.Ultra-violet B (UVB)-induced skin cell death occurs through a cyclophilin D intrinsic signaling pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,425(4):825-829.

Experiment study of cinobufagin anti-cancer effect on lung cancer cells

SHENGKai1,HUIPing-ping2△,LUJia-huan2

(1.MedicalCollege,ShanghaiTongjiUniversity,Shanghai200092,China;2.DepartmentofGastroenterology,ShanghaiTongrenHospital,Shanghai200332,China)

Objective Explore the potential of Huachan element resistance to lung cancer.Methods Cultivate the A549 lung cancer cells.After HuaChan element and cyclosporine A(CsA), safi rhzomorph A (SfA) role in the A549 lung cancer cells，testing cell survival and cell death, cell apoptosis rate and mitochondrial membrane potential (MMP).Establish the mice transplanted tumor model，After HuaChan element role in the mice transplanted tumor model, testing the tumor volume and the survival rate of mice. And collates data for statistical analysis.Results By mice transplanted tumor model,Data show that cyclophilin D (Cyp,cyclophilin D-D) rely on mitochondrial permeability transition pore (mitochondrial permeability transition pore,mPTP) open the adjustable by Huachan induced lung cancer non apoptotic cell death.Cyp inhibitors-D part of spore element-A (cyclosporine A,CsA),the blocker mPTP safi rhzomorph A (sanglifehrin A,SfA) extremely significantly hindered by Huachan induced mitochondrial membrane potential (mitochondrial membranepotential,MMPs) fall and A549 cell death (apoptosis).Conclusion The study found that Huachan inhibit the growth of the A549 lung cancer cells in the body.Research results show that HuaChan element is worth further study,as a new type of lung cancer drug resistance.

lung cancer; Huachan element; cyclophilin D; mitochondrial permeability transition pore

盛凯，男,在读研究生,主治医师,主要从事呼吸道相关肿瘤的研究。△

，E-mail：realhuiping@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.019

A

1672-9455(2015)14-2023-03

2015-01-25

2015-03-18)