高脂血、溶血标本对荧光定量聚合酶链反应测定低水平HBV-DNA的影响

刘小敏，唐恒锋，李文郎，杨美玲(.广东省深圳市龙华新区中心医院检验科 580；.广东省深圳市龙华新区人民医院 5809)



·论 著·

高脂血、溶血标本对荧光定量聚合酶链反应测定低水平HBV-DNA的影响

刘小敏1，唐恒锋1，李文郎1，杨美玲2
(1.广东省深圳市龙华新区中心医院检验科 518110；2.广东省深圳市龙华新区人民医院 518109)

目的 探讨高脂血、溶血标本对荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定低水平HBV-DNA检测结果的影响。方法 对收治的100例三酰甘油(TG)正常(TG≤1.46 mmol/L)、实时荧光定量PCR测定为(4.0～9.0)×103IU/mL的乙型肝炎患者采集血清标本，进行即刻检测，另外选择100份乙肝五项全阴且测不出HBV-DNA的高TG标本和100份乙肝五项全阴且测不出HBV-DNA的全血标本分别制备成高脂血、溶血血清标本，同时进行高脂血和非高脂血、溶血血清和非溶血血清的HBV-DNA荧光定量PCR检测，并进行配对t检验。结果 高脂血和非高脂血、溶血血清和非溶血血清的HBV-DNA水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论 高脂血、溶血标本低水平HBV-DNA荧光定量PCR定量检测结果较空腹采集即刻检测的结果降低。

标本； 溶血； 高脂血； 荧光定量聚合酶链反应

乙型肝炎(乙肝)是由乙肝病毒(HBV)引起的以肝损害为主的传染性疾病，流行广、发病率高。HBV-DNA的定量能客观反映HBV感染复制情况，为临床用药、治疗监测及预后判断方面提供有价值的参考依据[1]。目前用于HBV-DNA定量测定的基本方法是荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术，特异性和敏感性高，可实时检测，操作方便，定量范围宽，重复性好，不易引起污染等[2]。干扰PCR扩增的因素很多，除反应体系外，标本因素的影响不可忽视。作者就高脂血、溶血标本对低水平HBV-DNA 荧光定量PCR检测结果的影响作一些探讨，制订出适合本实验室的标本采集、储存、重留标准，以使实验结果更为可靠。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年3月至2013年3月本院肝病门诊三酰甘油(TG)正常(TG ≤1.46 mmol/L)、实时荧光定量PCR测定为(4.0～9.0)×103IU/mL的乙肝患者共100例。另外选择100份乙肝五项全阴且测不出HBV-DNA的高TG标本和100份乙肝五项全阴且测不出HBV-DNA的全血标本，均来自于2012年3月至2013年3月本院肝病门诊。

1.2 仪器与试剂 日本Sysmex K6000血液分析仪，AU5821生化分析仪，ABI-7500 PCR仪(美国)以及乙肝病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)。

1.3 方法 血红蛋白、总胆红素和TG的测定：100例乙肝患者分别空腹抽取静脉血3 mL，离心后将血清混匀，备用。采用日本的Sysmex K6000血液分析仪测定血红蛋白，AU5821生化分析仪测定总胆红素和TG。

脂血标本的制备：100份乙肝五项全阴且测不出HBV-DNA的高TG标本，分别离心后取血清混匀并用生理盐水稀释成TG浓度分别为35、25、15、10、5 mmol/L的溶液。将上述HBV-DNA阳性、实时荧光定量PCR 测定为(4.0～9.0)×103IU/mL的乙肝患者混合血清分成5组，分别与各浓度TG溶液1∶1混合，制成模拟脂血标本。非脂血血清TG≤1.46 mmol/L。

溶血标本的制备：100份乙肝五项全阴且测不出HBV-DNA的全血标本，分别离心弃掉血清后用生理盐水洗3遍，反复冻融至溶血；将溶血后的标本混匀并用生理盐水稀释成Hb浓度为30、60、120、240 g/L的溶液。将上述HBV 阳性、实时荧光定量PCR 测定为(4.0～9.0)×103IU/mL的乙肝患者混合血清分成5 组，分别与各浓度Hb溶液及生理盐水(对照组)1∶1混合，制成模拟溶血标本。非溶血血清血红蛋白浓度不超过2 g/L。

标本检测：HBV-DNA试剂盒采用中山大学达安基因股份有限公司的乙肝病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒，仪器采用美国ABI-7500 PCR仪，实验操作、反应体系及扩增条件严格按照试剂说明书进行。

1.4 评价指标 分析不同TG水平的脂血标本对低水平HBV-DNA荧光定量PCR检测结果的影响，分析不同血红蛋白水平的溶血血清对低水平HBV-DNA荧光定量PCR检测结果的影响。

2 结 果

2.1 乙肝患者高脂血血清与非高脂血血清的HBV-DNA定量检测结果 不同浓度的高TG血清和同组的非高脂血血清相比，低水平HBV-DNA的定量检测结果有所降低，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 乙肝患者高脂血血清与非高脂血血清的HBV-DNA定量检测结果±s)

注：和同组高脂血血清比较，*P<0.05。

2.2 乙肝患者不同程度的溶血血清与非溶血血清的HBV-DNA定量检测结果 不同血红蛋白含量的溶血血清和同组的非溶血血清相比，低水平HBV-DNA的定量检测结果有所降低，差异比较有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 乙肝患者不同程度的溶血血清与非溶血血清的HBV-DNA定量检测结果±s)

注：和同组溶血血清比较，*P<0.05。

3 讨 论

定量HBV-DNA能客观反映HBV感染复制情况，在临床用药、治疗监测及预后判断方面具有较高的临床参考价值[3]。目前国内用于HBV-DNA定量测定的方法基本上是荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术，这种技术具有实时测定，高特异性，高敏感性，快速方便，定量范围宽，结果重复性好，且不易引起污染等优点[4]。由于荧光定量PCR是监测原始待测核酸模板的扩增过程，任何干扰PCR扩增的因素都会影响扩增效率和定量的准确性。

干扰PCR扩增的因素很多，除反应体系外，标本因素的影响不可忽视。目前临床实验室开展的质量控制大多着重于实验过程中，实验前的质量控制常被忽视。在标本采集中标本溶血、高脂血等因素是常常会遇到的，而这些因素对荧光定量PCR测定低水平HBV-DNA检测结果有一定的影响。在乙肝抗病毒治疗的过程中，临床医生会根据HBV-DNA水平的变化对药物剂量进行调整，原则上以病毒含量下降为有效并直至其检测不出[5]。目前，诸多试剂的检测下限为1.0×103IU/mL，对于低于下限的以小于方式报告，而此时一般认为检测不出HBV。因此，当低水平HBV-DNA标本检测时受标本的储存、标本溶血、高脂血等因素的影响而使结果偏低甚至为阴性时，无法反映真实情况，如果据此改变治疗方案，将会延误治疗造成病情反复，给患者带来不必要的负担[6]。目前，国内外在标本的储存、标本溶血、高脂血等因素对低水平HBV-DNA荧光定量PCR测定结果的影响方面报道较少，故作者就高脂血标本、溶血标本对低水平HBV-DNA荧光定量PCR测定结果的影响作一些探讨，制订出适合本实验室的标本采集、储存、重留标准，以使实验结果更为可靠[7]。

血清TG是组成人血清乳糜微粒的主要物质，高脂血血清标本混浊的主要原因是因为血液中的低密度脂肪(乳糜微粒及极低密度脂肪等)增多引起的，高脂血程度可用血清TG的水平进行衡量[8]。因此，本组实验采用不同TG水平的高脂血血清标本和正常TG水平的血清标本进行对比，测定对低水平HBV-DNA荧光定量PCR测定的影响。本组试验结果显示，不同浓度的高TG血清和同组的非高脂血血清相比，低水平HBV-DNA的定量检测结果有所降低。作者认为高脂血因素造成结果偏低的原因可能有：(1)高脂血因素导致荧光猝灭，使得荧光信号强度降低；(2)高脂血抑制Taq酶的活性，使PCR的扩增效率降低。

临床研究已报道，血红素可以通过它的卟啉环与Taq酶进行不可逆的结合，抑制了Taq酶的活性，使PCR的扩增效率降低，最终使试验结果检测的HBV-DNA水平降低[9-10]。本组试验中，不同血红蛋白水平的溶血血清和同组的非溶血血清相比，低水平HBV-DNA的定量检测结果也有所降低。

总之，高脂血、溶血标本对低水平HBV-DNA荧光定量PCR测定结果有一定的影响，可根据具体情况制订出适合本实验室的标本采集、储存、重留标准，以使试验检测结果更为可靠。

[1]吴禹湘，吴瑞珊，林晓丹，等.溶血对荧光定量PCR检测不同含量HBVDNA的影响[J].分子诊断与治疗杂志，2012，4(3)：189-192．

[2]张翠莉，刘萍，魏文波.脂血和溶血对HBVDNA实时荧光定量PCR检测的影响[J].武警医学，2012，23(2)：150-152．

[3]郑有为，梁敏文，钱靖琳，等.荧光探针结合区序列突变对HBV DNA检测的影响[J].热带医学杂志，2012，12(7)：837-839．

[4]林森，易荣.实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素[J].国际检验医学杂志，2012，33(1)：127-128．

[5]李军，刘宏利，韩超，等.病毒接种剂量对HBV感染成年树鼩的影响[J].免疫学杂志，2012，28(12)：1056-1060．

[6]杨晓瑞，吴学炜，臧利敏，等.HBV cccDNA SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法的建立及初步应用[J].现代预防医学，2012，39(16)：4200-4204．

[7]彭红波，刘亚丽，陈旭姿.乙型肝炎病毒核酸荧光定量及血清标志物与肝功能检测的临床意义[J].检验医学与临床，2012，9(18)：2260-2262．

[8]白彦楼，高英堂，李莹，等.HBV cccDNA的水平及临床因素对肝细胞癌术后预后的判断价值[J].世界华人消化杂志，2012，20(9)：729-736．

[9]边立忠，宋广辉，赵素芝，等.LNA探针实时荧光定量PCR检测HBV DNA的研究[J/CD].中华临床医师杂志：电子版，2013，7(6)：2501-2506．

[10]蒋玲丽，王雪亮，肖艳群，等.荧光定量PCR测定HBV DNA测量不确定度评定的探讨[J].检验医学，2014，29(3)：241-244．

Influence of hyperlipemia and hemolysis specimens on fluorescence quantitative PCR determination of low level HBV-DNA

LIUXiao-min1,TANGHeng-feng1,LIWen-lang1,YANGMei-ling2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,LonghuaNewDistrictCentralHospital,Shenzhen,Guangdong518110,China;2.LonghuaNewDistrictPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518109,China)

Objective To investigate the influence of heperlipemia and hemolysis specimens on the fluorescence quantitative PCR determination results of low level HBV-DNA.Methods The serum samples were collected from 100 hepatitis B patients with normal triacylglycerol(TG) (≤1.46 mmol/L and (4.0-9.0)×103IU/mL by real time fluorescence quantitative PCR) in our hospital and performed the instant detection.In addition,100 high TG samples of hepatitis B 5-item negative and HBV-DNA non-detection and 100 whole blood samples of hepatitis B 5-item negative and HBV-DNA non-detection were collected and performed the simultaneous HBV-DNA detection of fluorescence quantitative PCR on the hyperlipemia and non-hyperlipemia specimens,hemolysis specimen and non-hemolytic serum.And the paired t test was conducted.Results The HBV-DNA detection levels had statistically significant differences between hyperlipemia and non-hyperlipemia specimens and between hemolytic serum and non-hemolytic serum (P<0.05).Conclusion The fluorescence quantitative PCR detection results of hyperlipemia and hemolysis specimens of low HBV-DNA level are reduced compared with those of instant detection for fasting collection specimens.

specimen; hemolysis; hyperlipemia; fluorescence quantitative PCR

刘小敏，男，主管检验技师，本科，主要从事生化检验、PCR检验。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.033

A

1672-9455(2015)21-3217-02

2015-02-18

2015-06-21)