老年医院肠杆菌科细菌耐药分析

翁绳凤，刘宏蕴，宋 洋，王 艳，商继周(北京老年医院检验科 100095)



·临床探讨·

老年医院肠杆菌科细菌耐药分析

翁绳凤，刘宏蕴，宋 洋，王 艳，商继周
(北京老年医院检验科 100095)

目的 了解北京老年医院2010～2012年临床常见肠杆菌科细菌耐药情况及研究耐碳青霉烯类细菌基因类别。方法 收集该院2010～2012年临床分离的肠杆菌科细菌1 528株，对亚胺培南和美罗培南敏感性下降的菌株采用改良Hodge试验进行产碳青霉烯酶确认，PCR扩增试验分析其耐药基因类别。结果 1 528株肠杆菌科细菌中，排前3位的细菌是大肠埃希菌(48.49%)、肺炎克雷伯菌(22.84%)及变形杆菌属(18.39%)。其中大肠埃希菌对3代头孢菌素类和喹诺酮类药物耐药率达80%以上；阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦，头孢哌酮/舒巴坦(含酶抑制剂复合抗菌药)对主要肠杆菌科细菌仍保持较高的抗菌活性；对美罗培南耐药5株，亚胺培南中介敏感4株。经改良Hodge试验确证：4株为产碳青霉烯酶株，均为肺炎克雷伯菌，PCR检测均为碳青霉希酶blaKPC-2基因型。结论 该院产碳青霉希酶的肠杆菌科细菌均为肺炎克雷伯菌且均为blaKPC-2基因型。临床与实验室应加强监控，防止耐药基因的传播。

肠杆菌科； 碳青霉烯酶； 抗药性； 基因型

老年人免疫功能低下，病情复杂，住院时间较长，广谱抗菌药物的不合理使用，造成耐药菌株的增加，已成为临床治疗棘手的问题。肠杆菌是临床重要医院感染菌，近年来肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药现象日趋增加[1-2]，给临床抗感染治疗带来极大困难。因此，本文对2010年至2012年临床分离的肠杆菌科细菌进行耐药分析并研究碳青霉烯酶KPC基因类别，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集本院2010年1月至2012年12月住院患者所有标本中分离出肠杆菌科细菌，共1 528株。剔除同一患者相同部位的重复菌株。

1.2 药敏试验 采用Phoenix100全自动分析仪进行药物敏感试验，K-B纸片扩散法作为药敏补充试验。结果按美国2010年版CLSI中判读标准报告。抗菌药物纸片及药敏试验培养基MH琼脂均为英国OXOID公司产品。质控菌株为大肠埃希菌ATC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603。采用WHONET5.6进行耐药性分析。

1.3 碳青霉烯酶检测 对头孢噻肟、头孢曲松和头孢他啶中一种或多种耐药；美罗培南最低抑菌浓度(MIC)≥2 μg/mL;亚胺培南MIC≥2 μg/mL，满足以上任一项的肠杆菌科菌株进行Hodge试验，确证是否产碳青霉烯酶。

1.4 改良Hodge试验 制备0.5麦氏浊度单位的大肠埃希菌ATCC25922 菌液，10倍稀释，用棉签取菌液均匀涂抹M-H平板，中间贴亚胺培南10 μg纸片，再用无菌接种环将待测菌株从纸片边缘向外划线；阴性对照用ATCC700603，阳性对照为KPC-2 的肺炎克雷伯菌。35 ℃培养16～18 h后观察结果。

1.5 PCR扩增及测序 Hodge 试验阳性的菌株送至北京大学临床药理研究所进行PCR扩增及测序，检测其耐药基因型。

2 结 果

2.1 肠杆菌科细菌分离情况 1 528株肠杆菌科细菌中，排前3位的细菌是大肠埃希菌741株(48.49%)、肺炎克雷伯菌349株(22.84%)及变形杆菌属281株(18.39%)。

2.2 药敏试验结果 1 528株肠杆菌科细菌中759株(49.67%)对第3代头孢菌素类(头孢噻肟)耐药，746株(48.82%)对第4代头孢菌素类(头孢吡肟)耐药，5株对美罗培南耐药，4株对亚胺培南呈中介敏感性。其中2株为大肠埃希菌，7株为肺炎克雷伯菌。碳青霉烯类(亚胺培南、美罗培南)、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦(含酶抑制剂复合抗菌药)对主要肠杆菌科细菌仍保持较高的抗菌活性，菌株对头孢菌素类及氟喹诺酮药物耐药性较高。结果见表1。

表1 2010～2012年常见肠杆菌科分离菌耐药率(%)

续表1 2010～2012年常见肠杆菌科分离菌耐药率(%)

注：1705为阳性对照，1706为阴性对照。

图1 改良Hodge试验结果

注：ndm-新德里金属酶。

图2 PCR扩增ndm基因结果

注：kpc-肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶。

图3 PCR扩增blaKPC 基因结果

2.3 改良Hodge 试验结果 4株Hodge 试验阳性，均为肺炎克雷伯菌，与阳性对照一样，菌落出现矢状生长，其他菌株均为阴性。见图1(以菌株编号10NDM120为例)。

2.4 PCR扩增blaKPC及DNA测序比对 Hodge试验阳性菌株送至北京大学临床药理研究所进行PCR检测。检测结果：实时定量荧光PCR法检测ndm基因为阴性，普通PCR法检测kpc基因为阳性。见图2和图3。

3 讨 论

本院大多数是老年患者，基础疾病多，容易反复感染，反复接受抗菌药物治疗更易出现耐药菌。研究数据也表明耐药率有所上升。如大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，原本敏感性较高的头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦现耐药率在25%～50%；对头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟的耐药率在50%～81%，可能与这些药物过度使用有关。本研究结果同时发现大肠埃希菌对环丙沙星和左氧氟沙星耐药率在80%以上；肺炎克雷伯菌耐药率也在38%～50%。超过中国细菌耐药监测研究组的数据[3](大肠埃希菌对环丙沙星、左氧氟沙星耐药率高达50%～60%)。这是因为氟喹诺酮类药物为广谱抗菌药物，被作为感染预防手段广泛用于临床。阿米卡星对主要3种肠杆菌科细菌仍保持较高抗菌活性(耐药率在10%～21%)。

目前，碳青霉烯类药物耐药的肠杆菌科细菌已在很多国家出现和被报道[4-7]，特别是产KPC和金属酶的肠杆菌科细菌在全球许多地区已出现暴发流行。鉴于此，CLSI提出，当肠杆菌科细菌对一种或多种第3代头孢菌素耐药并对碳青霉烯类药物的MIC有升高(厄他培南、亚胺培南、美罗培南之一的MIC≥2 μg/mL)，需对菌株进行碳青霉烯酶表型确证试验[8]。CLSI认为改良Hodge试验在确证碳青霉烯酶时敏感度和特异度均超过90%，虽然有报道称改良Hodge试验在检测产KPC型碳青霉烯酶菌株时会出现假阳性结果[9]，但灵敏度与特异度仍高于传统方法，而且操作相对简单，值得实验室推广，及早发现耐药株。

本研究中碳青霉烯酶类药物敏感性下降占1.4%左右，发现耐亚胺培南或美罗培南肺炎克雷伯菌。近年来研究发现炎症、基础疾病，氟喹诺酮类药物的应用，广谱头孢菌素的应用及曾接受碳青霉烯类药物的治疗成为对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌的独立危险因素[10]。

KPC-2首先在肺炎克雷伯菌中被发现[11]。产KPC-2型碳青霉烯酶菌株在世界各地均有报道，已发现其宿主菌包括肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、沙门菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌[12-15]。本次研究显示本院产碳青霉烯酶细菌均为肺炎克雷伯菌且基因型为blaKPC-2，未发现其他产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌。目前碳青霉烯类抗菌药物对常见肠杆菌科细菌仍保持较高的抗菌活性(耐药率低于2%)，是目前治疗多重耐药肠杆菌科细菌引起的严重感染的首选。但研究显示在本院这类药也在面临挑战，出现不同程度耐药。虽然出现例数不多，但也是预警信号，细菌耐药监测是一项长期而重要的工作，临床与实验室应重视对此类细菌的监测，防止耐药基因在细菌间传播。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.048

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1672-9455(2015)21-3250-03

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2015-06-28)