荧光定量PCR检测女性生殖道解脲脲原体原体的应用评价

黄 会，赵香依，吴多荣，姚 敏

(1.中南大学湘雅医学院附属海口医院检验科，海南 海口 570208；2.乐东县人民医院检验科，海南 乐东 572500)

荧光定量PCR检测女性生殖道解脲脲原体原体的应用评价

黄 会1，赵香依2，吴多荣1，姚 敏1

(1.中南大学湘雅医学院附属海口医院检验科，海南 海口 570208；2.乐东县人民医院检验科，海南 乐东 572500)

目的 了解荧光定量PCR检测解脲脲原体（Uu）敏感性、特异性及其临床应用价值。方法收集海口人民市医院2013年3～5月妇产科门诊泌尿生殖道感染患者生殖道标本共154例，同时进行荧光定量PCR和液-固体培养法检测Uu，以液-固体培养法作为金标准，对荧光定量PCR诊断试验进行方法学评价。结果154例标本中，液-固体培养法即金标准检测阳性64例，荧光定量PCR检测阳性69例，两者同时阳性63例，同时阴性84例，荧光定量PCR检测Uu敏感性是98.44%(63/64)，特异性是93.33%(84/90)，假阳性率是6.67%(6/84)，假阴性率是1.56%(1/64)，阳性预测值是91.30%(63/69)，阴性预测值是98.82%(84/85)，总符合率是95.45% (147/154)。χ2检验显示，两种方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)，计算Kappa>0.75，表明两种方法检测结果的一致性程度较好。结论荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异好、检测快速的优点，且与培养法一致性也较高，具有一定的临床应用价值。

荧光定量PCR；解脲脲原体；应用

解脲脲原体(Uu)是1954年Shepard首先从非淋球性菌尿道炎患者的尿道分泌物中分离获得，是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，在特定的环境下可以治病，主要引起生殖道和泌尿道炎症，临床上女性表现为尿道炎、阴道炎、输卵管炎、子宫内膜炎、不孕、异位妊娠等[1-2]。近年来Uu引起的泌尿生殖道感染有增多趋势，相关的耐药性报道不断增加[3-6]，因此检测方法逐渐引起人们的重视。液-固体培养法灵敏度强、特异性高，准确性好，被公认为检测的“金标准”[7]，但检测时限长，检验要求高，操作步骤繁琐，故不被临床广泛应用，多数应用于科研。荧光定量PCR是近几年发展起来的分子生物学技术，因其灵敏度好，检测时间短而越来越受到青睐。本研究以液-固体培养作为检测的金标准，考察荧光定量PCR的敏感性及特异性，探讨荧光定量PCR的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 本试验标本来源于海口市人民医院2013年3～5月154例泌尿生殖道感染的妇产科门诊患者。由门诊医生采集女性生殖道标本，采集后的标本立即送检，荧光定量PCR检测的送往PCR室，培养检测的送往微生物室进行培养。

1.1.2 荧光定量PCR试剂、仪器 荧光定量PCR试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司，仪器采用Line gene荧光定量PCR仪，试剂均在有效期内使用，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.1.3 培养基 10B肉汤和A8琼脂平板由法国生物梅里埃公司生产。

1.2 方法

1.2.1 液-固体培养法 将标本分别接种于10B肉汤和A8琼脂平板。肉汤培养温度35℃，大气环境，琼脂平板置于5%CO2的环境。接种后的肉汤每天两次观察颜色改变，1～4 d出现由黄变红产碱改变时，检查原种的琼脂平板是否有菌落生长，如果没有，迅速转接种变色的肉汤至琼脂平板，每天检查原种和转种的琼脂平板，A8琼脂平板在接种后1～3 d出现的圆形棕色菌落，直径在10～100 μm，判断为解脲脲原体[8]。

1.2.2 荧光定量PCR方法 将送检标本插入装有1.5 ml灭菌生理盐水的离心管中，充分震荡混匀，挤干，12 000 rpm离心5 min；去上清，沉淀加灭菌生理盐水1 ml混匀，12 000 r/min离心5 min；去上清，沉淀加入50 μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10 min；12 000 r/min离心5 min，备用；阴性质控品、阳性质控品管各加入等量DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10 min，离心备用。取PCR反应管若干，分别加入处理后的标本(阴性、阳性质控品)上清液2µl，8 000 r/min离心数秒，放入仪器样品槽，待分析结果。阳性结果：增长曲线程S型曲线；阴性结果：如果增长曲线不呈S型曲线则实验结果判为样品的DNA含量＜5.0×102基因拷贝。

1.3 统计学方法 以培养法为金标准，应用SPSS 20.0软件进行配对设计的McNemer χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义，计算Kappa值，评价两种方法一致性程度。

2 结果

2.1 荧光定量PCR与液-固培养法检测结果比较 荧光定量PCR与培养法同时检测154例标本，其中荧光定量PCR检出Uu阳性69例，阴性85例；培养法检出阳性64例，阴性90例：两者同时阳性63例，同时阴性84例，有6例经培养法检出阴性而PCR检出阳性，有1例经培养检出阳性而PCR检出阴性。两种方法检测结果经χ2检验，差异无统计学意义(P> 0.05)。计算Kappa=0.907>0.75，表明两种方法检测结果的一致性较好。

2.2 荧光定量PCR检测Uu的诊断试验评价结果 敏感性(Sen)=63/(63+1)×100%=98.44%；特异性(Spe)=84/(84+6)×100%=93.33%；假阳性率(FPR)=6/ (6+84)×100%=6.67%；假阴性率(FNR)=1/(1+63)× 100%=1.56%；阳性预测值PV+=63/(63+6)×100%=91.30%；阴性预测值PV-=84/(84+1)×100%=98.82%；总符合率=(63+84)/(63+6+1+84)×100%=95.45%。

3 讨论

荧光定量PCR技术是近年来兴起的检测技术，该方法操作相对简单，时间较短，能够对支原体进行定量，逐渐被大型综合性医院广为应用[9-11]，但其检测效果尚需进一步的临床评价。本研究以液-固体培养法为标准对荧光定量PCR诊断试验进行评价。PCR与培养检测阳性分别69例和64例，同时阳性63例，同时阴性84例，其中有6例经培养法检出阴性而PCR检出阳性，有1例经培养检出阳性而PCR检出阴性，经χ2检验，P>0.05，表明荧光定量PCR与培养法检测结果之间差异无统计学意义，与周才丽等[12]和王玉珍等[13]的报道一致。对于评价两种方法的一致性，Kappa=0.907>0.75，说明两种检测方法检测结果一致性较好。荧光定量PCR敏感性为98.44%，特异性为93.33%，说明其敏感性高，特异性好。总符合率为95.45%，总符合率又称为总的正确率，总正确率越大，说明其灵敏度和特异度之和越高，假阳性与假阴性之和越小。阳性预测值为91.30%，阴性预测值为98.82%，假阳性率既误诊率6.67%，可能原因：一是PCR扩增引物特异性不强，扩增出无关的相似核苷酸序列；二是标本污染了目标DNA序列；三是6例假阳性患者可能是经治疗后培养显示已转阴性，而PCR方法能检测出死的病原菌。假阴性率既漏诊率为1.56%，可能原因：一是标本中含有DNA扩增的抑制剂；二是裂解液中蛋白酶K浓度低；三是标本处理或模板制备过程导致模板丢失。

临床诊断Uu多数采用液体培养基结合药敏试验判断结果，这种方法易出现假阳性，且存在较为严重的污染问题[14]，确切的诊断需要接种于固体培养基并见到UU菌落，该方法是被公认为检测Uu的“金标准”。试验中经液体培养变红色的86例，转种固体培养后仅有82例出现Uu菌落，这提示我们培养物颜色的改变也不一定都是支原体，可能是其他微生物如变形杆菌、肠杆菌、克雷伯氏菌和酵母菌等污染所致假阳性结果，在平时的工作应注意标本污染导致的假阳。

综上所述，荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性好、检测快速的优点，同时避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染，且与液-固体培养法一致性较好，能对临床快速诊断Uu提供很大帮助，在临床工作中具有一定的应用价值。

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Application of fluorescence quantitative PCR for detection of Ureaplasma urealyticum in female genital tract.

HUANG Hui1,ZHAO Xiang-yi2,WU Duo-rong1,YAO Ming1.1.Department of Clinical Laboratory,Haikou Hospital Affiliated to Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Ledong County,Ledong 572500,Hainan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the sensitivity,specificity,and application of fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)for detection of Ureaplasma urealyticum(Uu)in female genital tract.MethodsA total of 154 specimens of patients with genital tract infections were detected by FQ-PCR and liquid-solid culture at the same time.All specimens were collected in Haikou People's Hospital from March 2013 to May 2013.ResultsIn the 154 specimens, 64 and 69 samples were revealed as positive according to the golden standard method and FQ-PCR method respectively,with 63 samples positive and 84 negative for both the golden standard method and FQ-PCR method.For FQ-PCR, the sensitivity rate was 98.44%(63/64),and the specificity rate was 93.33%(84/90),with the false positive rate of 6.67%(6/84),the false negative rate of 1.56%(1/64),positive predictive value of 91.30%(63/69),negative predictive value of 98.82%(84/85),and the total coincidence rate of 95.45%(147/154).χ2test results showed that there was nostatistical significant difference between the results of the two methods(P>0.05),and the consistency was good(Kappa>0.75).ConclusionFQ-PCR has the advantages of high sensitivity,good specificity,rapid detection,and high consistency with culture,and thus has certain clinical application value.

Fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR);Ureaplasma urealyticum;Application

R711.3

A

1003—6350（2015）18—2720—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0987

2015-01-28)

黄 会。E-mail：19599948@qq.com