球毛壳菌引起杭白菊叶枯病的首次报道

马婉琴，蔡 苏，钱永生，王呈辉，楼钰函，倪炎栋，王慧中，吴剑丙

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州310036）

杭白菊（Chrysanthemummorifolium）又称甘菊、茶菊，是我国传统的栽培药用植物，也是浙江省道地药材“浙八味”之一.除其药用功能外，还是饮品菊花茶中一个很好的品种，常饮可清热解毒、养肝明目，因此受到广大消费者的青睐［1-2］.20世纪以来，随着医药、食品和饮料产业的崛起，杭白菊的市场需求量不断增加.然而，近年来连作、重肥、环境等因素导致根腐病、叶枯病、病毒病等病害日益突出，加上化学农药的滥用，大大降低了杭白菊的食用品质和观赏价值［3］.本研究对磐安地区杭白菊的致病菌进行分离鉴定，并深入分析其致病机制，为今后制订合理的防治方案提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

植物材料：感病杭白菊植株于2013年6月采自浙江磐安中药材种植基地，病株表现为枯叶、叶边缘萎缩及全株枯死等症状.

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，蒸馏水定容至1 000 m L［7］；马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1 000 m L.

试验所用试剂：Taq DNA polymerase购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；PCR 产物克隆试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；其余常用化学试剂均由浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室提供.

1.2 病原菌的分离与纯化

采用平板分离技术对病原菌进行分离纯化：将带病组织用含70%酒精的棉花擦洗，用无菌刀片在病健交界处切取小块组织（约1.0 cm×1.0 cm），置于70%酒精中浸泡30 s，再用无菌水漂洗3次，将小块组织放在消毒滤纸上吸干水分.随后将病组织移到PDA 平板培养基上，待4～5 d长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝转接至新鲜PDA 平板上培养，多次转接直至菌落形态一致，最后将纯化好的菌落转移到PDA 斜面保存并留待后续观察研究.

1.3 病原菌的形态鉴定

将分离纯化后的菌株接种到PDA 平板上培养，记录菌落的生长速度、形态、颜色、产孢等性状.随后，选取培养1周左右的菌株，制成临时玻片，随机挑取发育成熟的孢子及菌丝，观测其形态特征，并用数码显微镜进行拍照记录.

1.4 病原菌的分子鉴定

采用简易DNA 提取法提取培养约4 d后的供试菌株DNA［4］.

利用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增真菌r DNA ITS区段［5］.

PCR 反应为25μL体系，包括10×buffer（含Mg2＋）2.5μL，d NTP（10 mmol／L）0.5μL 引物（ITS1／ITS4）（10μM／L）各0.3μL，Taq polymerase（2 U／μL）0.4μL，DNA 模板（80～100 ng／μL）2μL，dd H2O 19μL.

扩增条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最终72 ℃延伸10 min.

采用1.0%琼脂糖电泳检测PCR 产物，并送上海桑尼生物公司进行双向测序.测序结果在GenBank（http：／／.blast.ncbi.nlm.nih.gov／）数据库中进行BLAST 对比分析［6］.

1.5 病原菌致病性测定

1.5.1 真菌孢子制备

将活化后的真菌菌丝接种到PDB液体培养基中，25 ℃，170 r／min振荡培养2～3 d，获得大量真菌孢子.用dd H2O 将真菌孢子稀释成不同浓度梯度（104、106、108spores／m L）备用.

1.5.2 致病菌侵染实验

将活化后的新鲜菌块接种于健康无病且带有伤口的杭白菊叶片上，在适宜的湿度和温度下培养.每天观察记录叶片的发病症状，并以dd H2O 作为空白对照［7］.每组处理设置7个重复，整个实验重复3次.待叶片表现症状后对病斑进行组织分离，鉴定分离病菌是否与原始病菌相同.

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态和分子鉴定

观察发现，所分离获得的真菌F13N-1b菌丝最初呈白色，3 d后菌丝中间出现淡褐色.菌丝生长速度较为缓慢，活化后约6 d能长满平板（图1C）.在显微镜下，菌丝有横隔，呈稍弯曲或直状，微粗糙.孢子呈广卵形而两端略尖，形态与球毛壳菌（Chaetomiumglobosum）非常相似（图1D）.

同时，本研究扩增获得F13N-1bITS区域片段，经测序发现该序列长576 bp（图2）.与Genebank中的真菌ITS进行序列比对及系统发育分析，发现该菌与球毛壳菌聚在一个分支上，并与已报道的球毛壳菌ITS（登录号为JN689341）相似度达100%（图3）.因此，认为本研究所分离获得的杭白菊叶枯病致病菌F13N-1b 为球毛壳菌.

2.2 病原菌的致病性测定

接种2～3 d后，叶片开始出现患病症状.叶片尖端发黄，逐渐由局部扩展到整个叶缘，呈黄褐色的叶缘病斑.其后病斑逐渐向叶片基部蔓延，直至整个叶片变为褐色或灰褐色，最后叶片卷曲枯萎（图1B）.在实验结束时，所有接种叶片均出现感病症状，其症状与之前采集的原始感病叶片症状相似（图1A）.随后，我们对发病叶片上的致病菌进行分离鉴定，发现该病菌仍为原始接种病菌.因此，研究结果完成了科赫氏法则验证，证明球毛壳菌是引起杭白菊叶枯病的致病菌.

图1 杭白菊叶枯病症状及病原菌形态图Fig.1 Symptoms of leaf blight disease of Chrysanthemum

图2 F13N-1b ITS序列Fig.2 ITS sequence of F13N-1b

图3 基于真菌F13N-1b和其他相关真菌ITS核苷酸序列构建的系统发育树（采用DNAMAN 软件邻接法构建而成）Fig.3 Dendrogram showing the phylogenetic relationship between F13N-1b and other representative fungi based on multiple alignments of ITS nucleotide sequences（The tree was generated using the neighbor-joining method in DNAMAN software）

3 讨论

浙江省作为全国中药材重点产区之一，其生产的“浙八味”在国内外享有盛誉.杭白菊是浙江省的重要栽培药用植物之一，常见病害包括根腐病、叶枯病、病毒病等问题长期存在，一直为生产者所关注，近年来更有加重的趋势.然而，生产者只是从发病症状来判断病因，从而进行病害防治工作，这为病害的精确、高效防治增加了难度.因此，弄清病原菌及其发病机制，将为病害防治提供准确的指导.已有的研究认为，杭白菊叶枯病是由真菌半知菌亚门菊壳针孢菌（Soptoriachrysanthemella）侵染所致，初期叶片上出现圆形或椭圆形大小不一的紫褐色病斑，病斑周围褪绿，中部呈灰白色，后期出现黑色小点，逐渐扩展致叶片枯死［8］.然而，我们发现磐安地区栽种的杭白菊其叶枯病表现的症状并不相同，枯斑发生在叶片边缘，叶缘枯萎卷曲，最后导致叶片及整个植株枯萎死亡.为明确该致病菌的分类地位，我们结合形态及分子两种鉴定方法，对病原菌进行分离鉴定，并结合病菌致病过程，最后确定该病菌为球毛壳菌.随着种植年代的变化，以及采样地区的不同，病原菌种类也发生了改变.

已有的报道认为球毛壳菌是一种来源于土壤的腐生菌，是纸张、棉布等工业制品发酶的病原菌，具有很强的纤维素分解能力［9］.同时发现球毛壳菌是某些植物的内生真菌，对棉花枯萎病菌、油菜白斑病菌、小麦赤霉病菌都有抑制作用，具有一定的病虫害防治意义［9-10］.临床研究发现球毛壳菌可引起皮肤、内脏的暗丝孢酶病等［11］.本研究在国内外首次发现球毛壳菌可对植物致病，导致其减产，在生产上应引起重视并采取合理的防治措施.

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［6］汪汉成，黄艳飞，王进，等.烟草种子携带病原真菌的分离与鉴定［J］.中国烟草科学，2014，35（5）：84-88.

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［10］兰楠，祁高富，喻子，等.油菜内生真菌的分离、鉴定及抑菌作用［J］.华中农业大学学报，2011，30（3）：270-275.

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