精子DNA结构完整性与年龄、精子浓度、活力及形态的相关性研究

董波　宋焱鑫　谷玉　郭杰

摘要：目的 探讨精子DNA结构完整率与不育患者年龄、精子浓度、活力及形态的相关性。方法 回顾性分析2013年1月～2014年5月到我中心生殖医学研究所行精子DNA结构完整性检查的不育症患者874例，以染色质扩散法，进行检测，其中异常者80例。结果 DNA结构完整率正常组与异常组在年龄、精子浓度、活力及形态学有无统计学差异。结论 年龄、精子浓度、活力均跟精子DNA结构完整性有相关性，精子形态学与精子DNA结构完整性无明显相关性。

关键词：年龄；精子浓度；精子活力；精子形态；精子DNA结构完整性

在不育夫妇中，男性不育因素约占50%[1]，精子DNA损伤可能影响辅助生殖技术（ART）的结局，增加复发性自然流产的发生率及卵胞浆内单精子注射（ICSI）后代的遗传风险等相关风险[2]。因此精子DNA完整性检测不仅有助于探索不育的病因，而且有望成为ART治疗结局的重要评估手段[3]。睾丸局部温度增高、严重身心疾病、高热、环境毒物、吸烟、嗜酒、药物和年龄增高等原因都可能造成精子DNA的损伤，相关研究证实，空气污染和吸烟均会导致精子DNA的碎片化程度增高[4]。本研究通过分析患者的精子浓度、活力及形态的常规检查和精子DNA结构完整性检测结果，并结合患者年龄，以探讨不育患者年龄、精子浓度、活力及形态学与精子DNA完整性的相关性。

1资料与方法

1.1一般资料 选择2013年1月～2014年5月在洛阳市妇女儿童医疗保健中心生殖医学研究所就诊的行精子DNA完整性检测的874例男性不育患者作为本次研究对象。纳入标准为：年龄在20～50岁（含20及50岁）的身体健康、无家族遗传性疾病、无睾丸外伤及性功能障碍病史、无不良生活习惯（嗜酒、吸毒等），睾丸、附睾及输精管体检无明显异常[5]的男性患者。

1.2方法

1.2.1精液标本收集 禁欲2～7d，手淫法取精液于一次性精液采集器内，置37℃温箱液化，常规记录精液的体积、pH值。

1.2.2 精液常规检查 采用康泰CMS100医学影像学工作站【康泰精子质量析系统】分析精子的浓度、活力。精液标本洗涤后，涂片，以（台资）珠海贝索生物技术有限公司的Diff-Quik试剂快速染色，应用康泰CMS100医学影像学工作站【康泰精子质量析系统】分析精子形态。

1.2.3精子DNA碎片检测 本研究方法采用精子染色质扩散法，试剂选用深圳市博锐德生物科技有限公司生产的精子DNA碎片检测试剂盒。精液标本主要处理过程：常规检查后以生理盐水调整液化的新鲜精子浓度至5～10×106/ml。取出精子浓度为5～10×106/ml的待测标本60μl加入已熔化的易熔凝胶管，充分混匀，37℃孵育待用。将包被载玻片置于2～8℃冰箱预冷5min取出，迅速加入30μl精子凝胶混合液于载玻片上，迅速盖上盖玻片，置于2～8℃冰箱，使其凝固。5min后从冰箱中取出载玻片，小心移去覆盖在上面的盖玻片。将载玻片立即垂直浸入盛有反应液A的反应池，20～28℃准确反应7min，取出载玻片，滤纸吸去背面及侧面残存液体，再将载玻片垂直浸入盛有反应液B的反应池内，20～28℃准确反应25min，取出载玻片，滤纸吸去背面及侧面残存液体，再将载玻片水平浸入蒸馏水中5min，其间换水1～2次。将载玻片依次放入分别盛有70%、90%和100%乙醇的反应池中各2min。空气中自然干燥后，载玻片以瑞氏染液15～20滴覆盖，稍等片刻再缓慢地加入瑞氏缓冲液30～40滴，以洗耳球轻轻吹打混合染液，室温15min后以流水轻轻冲洗染片。自然干燥或吹干后，在高倍显微镜下观察500个精子，计数存在DNA碎片的精子数量。精子DNA碎片判定标准为：精子头部仅产生较小的光晕或无光晕，单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3。精子DNA碎片率（%）=存在DNA碎片精子数÷被观察精子总数×100%。正常参考值：精子DNA碎片率<25%。

1.3统计学分析 数据分析采用SPSS13.0软件完成，计量资料以x±s表示。各组组间的分析采用单因素方差分析。不育男性精子DNA完整程度与年龄、精子浓度、活力和形态的相关性分析采用Pearson相关系数并进行显著性检验。以P<0.05为差异具有显著统计学意义，P<0.01为差异具有极显著统计学意义。其中浓度、活力及精子形态学各参数按照WHO第五版规定[6]。

2结果

2.1年龄与精子DNA完整程度的关系 年龄以35岁为界限分组，<35岁者共计551人，DNA碎片率检测x±s为13.3±6.73；≥35岁者共计323人，DNA碎片率检测x±s为14.9±6.83。结果显示年龄越小，DNA碎片率越低，且具有统计学意义（P值<0.05），见表1。

2.2精子浓度与精子DNA完整程度的关系 按照浓度<15×106/ml，15～100×106/ml，>100×106/ml，分成三组检测其DNA碎片率x±s分别为13.8±7.30，13.5±6.77，15.3±6.77，结果显示，当精子浓度低于正常值15×106/ml时，与浓度正常时DNA碎片率无明显统计学差异（P>0.05）；当精子浓度>100×106/ml比浓度15～100×106/ml时DNA碎片率增高，且具有统计学意义（P值<0.05），见表2～表3。

2.3精子总活力与精子DNA完整程度的关系 按精子总活力正常及不正常分组，总活力<40%者，总活率≥40%者，其DNA碎片率检测x±s为18.1±8.32，13.1±6.44。结果显示，当精子活力≥40% DNA时碎片率低，精子活力<40% 时DNA碎片率高，且具有明显统计学意义（P值<0.05），见表5。

2.4精子形态学与精子DNA完整程度的关系 以正常形态率≥4%分界，<4%者与≥4%者DNA碎片率检测x±s分别为15.2±6.35，13.7±6.88，结果显示，精子形态学分析正常者比形态异常者DNA碎片率均值偏低，但无明显统计学意义（P值>0.05）。见下表：

3讨论

精子异常是导致男性不育的主要原因之一。目前男性精液常规检查主要包括精液的量、pH值、精子的浓度、活力和形态[7]。但临床中大约有15%的男性不育症患者，精液常规检查是正常的[8]。因此，仅仅进行精液常规检查而进行男性生育能力以及助孕治疗结局的判定还是不够的。在过去的10 年中，人们越来越重视精子DNA完整性在男性不育诊疗中的作用。国外文献报道较多，但国内相对有限，且认识不一，有学者认为精子DNA完整性与精液常规各参数无相关性[9]；有的认为精子DNA碎片化指数与精子的密度、总活动率及精子正常形态率具有负相关性[10]；还有的认为与男性年龄显著性正相关，与直线运动精子百分率显著性负相关[11]。为进一步研究精子DNA完整性的临床意义，我们从2013年1月起，对在我中心生殖医学研究所接受辅助生育技术治疗的患者进行了精子DNA碎片与辅助生殖技术相关性的研究，该项目在洛阳市科学技术局立项（项目编号1302018B）。同时，对不育症门诊就诊的男性患者精子DNA结构完整性与年龄、精子浓度、活力及形态等参数的相关性进行了研究，结果发现，患者年龄大于35岁时，DNA碎片率高于小于35岁者，说明精子DNA碎片率与年龄有关；精子浓度在100×106/ml以下时，精子DNA碎片率无明显差异，当浓度大于100×106/ml时，精子DNA碎片率明显增高，且具有统计学意义，原因尚不明确；精子总活力小于40%时，精子DNA碎片率明显增高，说明精子DNA碎片率与活力有关；精子形态学方面，精子正常形态与精子DNA碎片率无统计学意义，无明显相关性。本研究可以得出，精子DNA碎片率与年龄、浓度及活力均有关，而与形态无关。

参考文献：

[1]World Health Organization（WHO）.Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction[M].4th ed.Cambridge：Cambridge University Press，1999：1-26.

[2]徐志鹏，孙海翔，张宁嫒.精子DNA损伤与辅助生殖技术[J].中华男科学杂志，2008，149（3）：259-263.

[3]Zini A，Fischer MA，Shafir S，et a1.Prevalence of abnormalsperm DNA denaturation in fertile and infertile men[J].Urology，2002，60（6）：1069-1072.

[4]Rubes J，Selevan SG，Rvevson DP，et a1.Episodic air pollution is associated with increased DNA fragmentation in human sperm without other changes in semen quality[J].Hum Reprod，2005，20（10）：2776-2783.

[5]Benchaib M，Braun V，Lornage J，et a1.Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique[J].Hum Reprod，2003，18（5）：1023-1028.

[6]世界卫生组织.人类精液检查与处理实验室手册[S].第五版.2010.

[7]World Health Organization（WHO）.Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction[M].Cambridge：Cambridge University Press：1999.

[8]Agarwal A. Allamaneni S S. Sperm DNA damage assessment： a test whose time has come[J]. Fertil Steril， 2005， 84（4）：850-853.

[9]杨译.性不育患者年龄与精子DNA碎片和精液常规参数的相关性分析[J].中国性科学2012（2）.

[10]孙超，徐志鹏，石亮，等.不育症患者精子DNA碎片化指数与精子常规参数关系的研究[J].南京医科大学学报：自然科学版，2011（4）：565-567.

[11]方力，楼丽君，叶英辉，等.精子DNA碎片率与男性年龄、精子活动力和体外受精结局关系的研究[J].中华医学遗传学杂志，2011（4）：432-435.

编辑/申磊