齐墩果酸诱导多种小鼠胚胎干细胞向生殖细胞方向分化研究

万 谦 姚奏英 伍林涛 陆 华

(1 成都中医药大学第二附属医院，成都，610041; 2 四川省计划生育研究所，成都，610041; 3 成都中医药大学临床医学院，成都，610075; 4 贵州省油菜研究所，贵阳，550008)

齐墩果酸诱导多种小鼠胚胎干细胞向生殖细胞方向分化研究

万 谦1，2姚奏英2，3伍林涛4陆 华1，2

(1 成都中医药大学第二附属医院，成都，610041; 2 四川省计划生育研究所，成都，610041; 3 成都中医药大学临床医学院，成都，610075; 4 贵州省油菜研究所，贵阳，550008)

目的：寻找一种能诱导多种胚胎干细胞向生殖细胞方向分化的化合物，并以常用的诱导物维甲酸(Retinoic Acid,RA)作为阳性参照物。方法：分别培养小鼠胚胎干细胞1B10、D3、R1/E，诱导它们形成拟胚体，让拟胚体贴壁生长，加入特定化合物诱导贴壁细胞分化，诱导72 h后，提取被诱导细胞的RNA，再合成cDNA，最后利用实时荧光定量PCR检测各被诱导细胞中与生殖分化相关的基因的表达水平的变化。结果：发现齐墩果酸(Oleanolic Acid，OA)显著上调了所有被研究的小鼠胚胎干细胞的生殖分化关键基因的表达水平，同时发现阳性参照物RA仅能诱导1B10、R1/E，而不能诱导D3向生殖细胞方向分化。结论：OA能诱导多种胚胎干细胞向生殖细胞方向分化，诱导能力方面具有比常用诱导物维甲酸更广泛的普遍性。

齐墩果酸;小鼠胚胎干细胞;体外分化诱导物;生殖方向分化

胚胎干细胞来源于胚胎在囊胚时期的囊胚中的内细胞团，被发现具有强大的分化能力，在体外能被特定的化合物或者蛋白质因子诱导分化为多种细胞，比如心肌细胞[1]、表皮细胞[2]、血管细胞[3]、角化细胞[4]、神经细胞[5]、生殖细胞[6]等等。目前，体外诱导系统被广泛地采用来研究胚胎干细胞的分化，现已有多种诱导物被发现，包括PDGF，BMP2，BMP4，Activin A，bFGF，Wnt3a，RA，FGF，DMSO，and TGF-b1[7-9]。

近年来，新的诱导物或者诱导方法频繁被发现，使得胚胎干细胞的体外诱导系统不断被充实，说明体外诱导系统有广泛的空间可以被挖掘。很多中药单体被发现具有令人感兴趣的功能，所以，我们希望从中药单体中寻找新的可诱导胚胎干细胞向生殖细胞分化的物质。另一方面，目前被研究的胚胎干细胞有多种细胞株，拿小鼠胚胎干细胞来说，就有1B10、D3、R1/E、CE3、J1等，这些细胞株虽然都来自于囊胚的内细胞团，但是其遗传背景是有差别的，同一种诱导物能否诱导多种胚胎干细胞的定向分化的较系统的考察未见报道，所以，我们也希望考察新发现的诱导物和常用诱导物RA在诱导能力方面的普遍性。

本研究中，我们首先发现了OA能诱导1B10的生殖分化，同时发现RA有类似作用，接着我们考察了诱导能力的普遍性，发现：OA能诱导1B10、D3、R1/E的生殖分化，而RA仅能诱导1B10、R1/E的生殖分化，不能诱导D3的生殖分化。

综上所述，本研究一方面充实了体外诱导系统的内容，另一方面首次较系统地考察了一种诱导物诱导能力的普遍性。

1 材料

1.1 细胞株 1B10细胞株为四川大学刘聪老师馈赠，D3、R1/E细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药品和试剂 OA为成都中医药大学药学院制备，纯度98%，RA购买自Sigma公司，货号：R2625，纯度98%，OA和RA的原液浓度都为3 mg/mL，溶剂都为DMSO；DMEM高糖培养液、胎牛血清(FBS)、细胞培养用双抗(青霉素和链霉素)、磷酸缓冲液(PBS)、细胞消化用胰蛋白酶均购自成都哈里公司，批号分别为20130401、20130405、20130315、20130505、20130408；非必需氨基酸(NEAA)，美国Gibco公司，批号：03985 K11；β-巯基乙醇(β-ME)，美国Gibco公司，批号：862986；白血病抑制因子(LIF)，美国Millipore公司，批号：1993949。普通细胞6孔培养板和超低吸附培养6孔板购自美国Corning公司，批号分别为04718601、10312041；RNA提取试剂盒Tri Reagent，美国Molecular Research Center公司，批号：4071；反转录试剂盒iSCRIPT cDNA SYNTHES，美国Bio-Rad公司，批号：T730001972；cDNA合成试剂盒iQ SYBR GRN，美国Bio-Rad公司，批号：T760000082。

1.3 仪器 UPR-I-10T纯水机(中国优普公司)；3111型CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(中国苏州净化公司)；TDL-40B型大体积离心机(中国Anke公司)；Legend Micro 17R型高速台式冷冻离心机(美国Thermo公司)；DMI3000B型倒置显微镜(德国Leica公司)；CFX96型定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 小鼠胚胎干细胞的培养 培养小鼠胚胎干细胞的饲养层细胞使用小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3。培养NIH3T3的培养液为DMEM高糖培养液，其中含10% FBS、100 U/mL盘尼西林、0.1 mg/mL链霉素。培养小鼠胚胎干细胞的培养液为DMEM高糖培养液，其中含17% FBS、100 U/mL盘尼西林、0.1 mg/mL链霉素、0.1 mmol/L的NEAA、0.1 mmol/L的β-ME和1 000 U/mL LIF。待培养孔中的NIH3T3生长到90%汇合度时，加入丝裂霉素C至终浓度为10 μg/mL，将培养板放入细胞培养箱中孵育3 h，而后用无菌PBS清洗细胞5遍。在培养孔中加入适量的小鼠胚胎干细胞的培养液，将相应的小鼠胚胎干细胞接种至培养孔，每天更换培养小鼠胚胎干细胞的培养液，4～7 d后，可见干细胞克隆出现。

2.2 拟胚体(EB)的诱导形成 诱导EB形成的培养液与培养小鼠胚胎干细胞的培养液成分一样，只是没有LIF。EB形成的操作程序如下：往培养孔中加入细胞消化用胰蛋白酶；将培养板放入细胞培养箱中消化3 min；吹打消化下来的细胞至细胞呈单细胞状态；细胞混合液放入细胞培养箱中静置30 min，以利用差速贴壁法分离饲养层细胞NIH3T3和小鼠胚胎干细胞；收集混合液静置后的上清液(大部分悬浮细胞为小鼠胚胎干细胞)，移入超低吸附培养板；24 h后，可观察到悬浮的类圆形的EB形成，再过24 h，收集所有EB待用。

2.3 相关化合物对小鼠胚胎干细胞形成的EB的干预 将收集得到的EB移入普通细胞培养板。24 h内EB贴壁并生长。24 h后，对相应的培养孔中分别加入RA和OA，终浓度都为3.0 μg/mL，同时设DMSO溶剂对照，干预72 h后。

2.4 实时荧光定量PCR分析(qPCR) 贴壁的EB被干预72 h后，利用RNA提取试剂盒Tri Reagent提取各孔的总RNA，而后以提取的RNA为模板利用cDNA合成试剂盒合成cDNA，最后以cDNA为模板利用Sybr Green Qpcr试剂盒进行qPCR分析，目标基因为11种与生殖分化相关的基因，分析中以β-actin为内参基因，具体基因名称和各引物序列,见表1。表1所列基因的功能可描述如下：Oct-4对于保持干细胞的多能性很重要，过低或者过高的Oct-4将导致干细胞分化[10]；GDF-9是向雌性生殖细胞分化的早期标记基因[11]；Stra8是向雄性生殖细胞分化的早期标记基因[12]；SCP3是减数分裂的早期标记基因[13]；Mvh是向雌性生殖细胞和雄性生殖细胞分化的早期标记基因[14]；ZP1，ZP2，and ZP3是卵子细胞形成的标记基因[15]；Itga6，Itgb1，and TP2是精子细胞形成的标记基因[16-17]；β-Actin被做为qPCR检测的内参基因。

表1 qPCR分析中的相关基因名称及引物序列

2.5 统计学处理 利用SPSS 13.0软件进行统计学分析，各干预组的数据与相应的DMSO溶剂对照的数据进行比较，比较采用独立样本t检验。P<0.05被认为有统计学意义。

3 结果

3.1 RA能诱导1B10、R1/E，同时不能诱导D3向生殖细胞方向分化 对于1B10，RA显著上调了GDF-9、Stra8、Mvh、ZP2、ZP3、TP2，非显著上调了Itga6、Itgb1，显著下调了Oct-4，非显著下调了SCP3、ZP1，小结起来：RA能启动1B10向雌性生殖细胞和雄性生殖细胞方向的分化；对于D3，RA显著上调了Stra8，显著下调了Oct-4、GDF-9、SCP3、Mvh、ZP3、Itga6、Itgb1、TP2，非显著下调了ZP1、ZP2，小结起来：RA不能启动D3向雌性生殖细胞和雄性生殖细胞方向的分化；对于R1/E，RA显著上调了GDF-9、Stra8、SCP3、Mvh、ZP1、ZP2、ZP3，非显著上调了TP2，显著下调了Oct-4，Itga6、Itgb1，非显著下调了Oct-4，小结起来：RA能启动R1/E向雌性生殖细胞方向的分化，不能诱导R1/E向雄性生殖细胞方向的分化。综上所述：RA能诱导1B10、R1/E，同时不能诱导D3向生殖细胞方向分化。见图1。

图1 RA对不同小鼠胚胎干细胞的11种与生殖分化 相关基因表达的影响 A：1B10；B：D3；C：R1/E

3.2 齐墩果酸能诱导1B10、R1/E、D3向生殖细胞方向分化 对于1B10，OA显著上调了GDF-9、Stra8、Mvh、ZP2、ZP3、TP2，非显著上调了Oct-4、Itga6、Itgb1，非显著下调了SCP3、ZP1，小结起来：OA能启动1B10向雌性生殖细胞和雄性生殖细胞方向的分化；对于D3，OA显著上调了GDF-9、Mvh、ZP3、Itga6、Itgb1、TP2，非显著上调了Oct-4、SCP3、ZP1，非显著下调了Stra8、ZP2，小结起来：OA能启动D3向雌性生殖细胞和雄性生殖细胞方向的分化；对于R1/E，OA显著上调了Stra8、SCP3、Mvh、ZP1、ZP2、Itga6、Itgb1、TP2，非显著上调了Oct-4、GDF-9、ZP3，小结起来：OA能启动R1/E向雌性生殖细胞和雄性生殖细胞方向的分化。综上所述：OA能诱导1B10、D3、R1/E向生殖细胞方向分化，见图2。

图2 OA对不同小鼠胚胎干细胞的11种与生殖分化 相关基因表达的影响 A：1B10；B：D3；C：R1/E

4 讨论

本研究发现了OA能诱导1B10、D3、R1/E等多种小鼠胚胎干细胞向生殖细胞方向分化，而研究中作为阳性药物对照的RA仅能诱导1B10和R1/E，不能诱导D3向生殖细胞方向分化，而且对于R1/E，RA仅能诱导其向雌性生殖细胞分化，不能诱导其向雄性生殖细胞分化。

小鼠胚胎干细胞1B10是E14TG2a(ATCC No.:CRL-1821)的亚克隆，其最终来源于129/Ola小鼠系，同时，当其被注射进入囊胚后，将形成生殖细胞[18]。小鼠胚胎干细胞R1/E(ATCC No.:SCRC-1036)来源于129X1×129S1系的雄性的3.5 d的囊胚，同时，其具有形成生殖细胞的能力[19]。小鼠胚胎干细胞D3(ATCC No.:CRL-11632)来源于129/Sv+c/+p系的3.5 d的囊胚，同时，当其被注射进入囊胚后，将形成生殖细胞[20]。综上所述，从ATCC的描述上，3种小鼠胚胎干细胞虽然来源有一些差别，但是都具有分化为生殖细胞的潜能，尚不能看出上述3种小鼠胚胎干细胞在成为生殖细胞方面的重大差别，所以RA和OA在诱导它们向生殖细胞分化的能力差别，更有可能是源自于RA和OA诱导潜能方面的差别。

RA和OA功能上的差别最终源自于结构上的差别。RA是维生素A的衍生物，是目前获得公认的胚胎干细胞的生殖分化诱导物[21]。OA为五环三萜类化合物，以游离或结合成苷的形式存在于白花蛇舌草、山楂、丁香、大枣、女贞子、枇杷叶、橡木及夏枯草等植物中[22]。OA有保肝、降糖、抗HIV和抗肿瘤等作用[23]。OA是补肾中药女贞子的主要有效成分之一[24]，较新的研究表明OA也具有调节中医药概念“肾精”的功能[25]。图3和图4展示了OA和RA的结构，可见两者结构差异较大，反映在诱导能力上OA强于RA。进一步的研究将探索OA类似物的诱导能力。

图3 齐墩果酸(OA)的结构图

图4 维甲酸(RA)的结构图

综上所述，在诱导小鼠胚胎干细胞向生殖细胞分化方面，OA比RA具有更广阔的适用对象。此研究结果不仅拓宽了外源的生殖分化诱导物的范围，也完成了较系统评估某种化合物诱导生殖分化能力的首次报道。本研究具有一定的创新性和一定的潜在实用性。

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[18][EB/OL].https://www.atcc.org/Products/All/CRL-1821.aspx?slp=1#generalinformation，2014-5-26.

[19][EB/OL].https://www.atcc.org/Products/All/SCRC-1036.aspx#generalinformation，2014-5-26.

[20][EB/OL].https://www.atcc.org/Products/All/CRL-11632.aspx?slp=1#generalinformation，2014-5-26.[21]Chen W，Jia W，Wang K，et al.Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2012，418(3):571-577.

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(2014-05-30收稿 责任编辑：徐颖)

Study on Oleanolic Acid Inducing Several Strains of Mouse Embryonic Stem Cells to Differentiation towards Germ Cells

Wan Qian1,2，Yao Zouying2,3，Wu Lintao4，Lu Hua1,2

(1TheSecondAffiliatedHospital,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610041,China; 2SichuanFamilyPlanningResearchInstitute,Chengdu610041,China; 3TheAffiliatedCollegeofMedicalSciences,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China; 4GuizhouRapeInstitute,Guiyang550008,China)

Objective:To find an agent which can induce several strains of embryonic stem cells to differentiate towards germ cells,with the common inducer retinoic acid (RA) as positive control.Methods:Different strains of mouse embryonic stem cells (mESC) 1B10,D3,R1/E were respectively cultured,and induced to form embryoid bodies (EBs) which were allowed to attach; different compounds were then added to intervene the attached cells; the intervene continued for 72 h and RNA were extracted and cDNA were synthesized; finally,real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR) assay were used to measure the transcriptional expression patterns of 11 reproductive differentiation related genes.Results:It was found that oleanolic acid (OA) can induce all 3 strains of mouse mESC to differentiate towards germ cells and the positive control RA can only induce mESC-1B10 and mESC-R1/E to differentiate towards germ cells.RA cannot induce mESC-D3 to differentiate towards germ cells.Conclusion:OA can induce several strains of embryonic stem cells to differentiate towards germ cells and it has broader universality than the positive control RA.

Oleanolic acid; Mouse embryonic stem cells; In vitro differentiation inducer; Differentiation towards germ cells

国家重点基础研究发展计划(973计划)“从不孕不育探讨“肾主生殖”理论的研究”的相关研究(编号：2010CB530403)；成都中医药大学实验技术项目(编号：063003)；成都中医药大学校基金(编号：ZRMS201248)
姚奏英为本文并列第一作者

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.021