15个鸡群体IL-2基因的遗传变异分析

赵会静，张敬敬，文 杰，刘冉冉，郑麦青，李庆贺，马月辉，赵桂苹

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

15个鸡群体IL-2基因的遗传变异分析

赵会静，张敬敬，文 杰，刘冉冉，郑麦青，李庆贺，马月辉，赵桂苹*

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

为了深入研究鸡IL-2基因的多态性及为鸡抗病育种提供理论依据，本研究以IL-2基因为研究对象，采用直接测序的方法对11个中国地方鸡品种、3个引进鸡品种和1个培育鸡品种共448个个体该基因的遗传变异进行了分析。通过DNA池和直接测序技术，共发现了13个突变位点。对所有个体的一段包含5个SNPs的区域进行分析，发现不同等位基因在15个鸡群体间分布存在显著差异，表明不同品种间IL-2基因具有丰富的遗传变异资源，可为抗病基因的选择提供素材；群体遗传学指标分析表明，H系京星黄鸡的遗传多样性最低，这与其品种形成过程一致，其他品种多样性差异不大；单倍型分析共发现23种单倍型，其中H1(CAACG)、H2(CAATT)、H4(TGTTG)、H9(TGTTG)、H11(TATCG)和H16(CATCG)为中国地方鸡品种特有或优势单倍型，可能与抗病能力相关。

鸡；IL-2基因；遗传多样性

一直以来，疫病是养鸡业的第一大天敌，尤其是一些烈性传染病，严重制约着家禽业的发展。目前我国禽病有80余种，其中传染病占75%左右，每年造成的经济损失十分巨大[1]。在现今集约化程度提高、饲养条件改变以及禽类疾病复杂化的背景下，家禽遗传育种者一直在不断的探索减少这种经济损失的途径。其中，选育抗病能力强的鸡品种、对鸡抗病力的遗传规律进行深入的研究成为从根本上解决问题的一个重要手段。

白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)是由T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，具有促进T、B淋巴细胞增殖和分化、增强单核细胞核NK细胞的杀伤活性、诱导淋巴因子激活杀伤细胞活性、促进其他细胞因子释放的功能，在机体的免疫应答系统中具有重要的调节作用[2]。鸡IL-2被认为是影响鸡免疫系统的发生及免疫调节的重要因子之一[3]。Q.L.Liang等[4]发现鸡胚成纤维细胞受到H5N1病毒感染后，IL-2 基因表达升高，并在整个感染过程中维持高表达状态。Y.C.Wang等[5]报道在25 mg·mL-1的玉米赤霉烯酮感染48 h，与对照组相比鸡脾淋巴细胞的IL-2 基因表达水平提高了4倍。 G.D.Raj等[6]研究发现，商品化鸡在感染传染性法氏囊病毒后，脾IL-2 基因的表达水平显著提高。此外，IL-2 可作为免疫治疗剂和免疫佐剂。李宏梅[7]用法氏囊疫苗联合应用对鸡细胞免疫水平的影响进行研究，结果表明，鸡IL-2 能够提高疫苗的免疫效果。同时，利用基因重组的方法将IL-2 基因和某种病毒基因重组获得IL-2 抗原重组蛋白，是研制新一代基因工程疫苗的有效途径。亓丽红等[8]构建了鸡IL-2 基因与新城疫病毒蛋白的重组质粒并用此质粒感染鸡胚胎成纤维细胞，结果表明，该重组质粒可提高细胞的抗体反应能力。H.Song等[9]将鸡IL-2 基因和艾美耳球虫遮光体抗原SO7基因分别插入pVAX1载体中制备疫苗，并用此疫苗免疫鸡，发现，IL-2 基因的表达能够明显增强艾美球虫疫苗的免疫原性。

对鸡IL-2基因序列多态性的研究也已经逐步开展。R.S.Sundick等[10]首次克隆了鸡IL-2基因mRNA序列，发现其mRNA全长747 bp，推测编码143个氨基酸。P.Kaiser等[11]采用RACE技术获得鸡IL-2全基因序列，对其基因组结构分析发现，该基因位于第4号染色体上，由4个外显子和3个内含子组成。此后，国内的众多学者相继克隆出了固始鸡、萧山鸡、白羽乌骨鸡等十多个地方品种的IL-2基因的mRNA序列，与R.S.Sundick等[10]公布的鸡IL-2基因序列的相似性均在97%以上，证明了鸡IL-2 cDNA的保守性，同时一些位于编码区的SNPs位点也被确定[12-14]。R.Tohidi等[15]研究表明，鸡IL-2 基因的变异与盲肠及脾中肠炎沙门氏菌感染显著相关，为鸡IL-2 基因在免疫性状中的作用提供了有力的证据。这些研究大多数只是关注少数个体的mRNA序列，而忽略了内含子上的变异以及群体水平的研究。本研究以11个中国地方鸡品种、3个引进品种和1个培育品种为研究对象，采用DNA池技术和直接测序方法对鸡IL-2基因的SNP进行筛选，然后选择其中遗传变异丰富的一端DNA区域，对该区域内的5个SNPs位点的基因型、杂合度、多态信息含量等群体遗传学属性以及不同群体单倍型的分布情况进行分析，并寻找可能与鸡抗病性相关的单倍型，为更加深刻的了解鸡DNA多样性与经济性状多样性之间的关系奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以11个中国地方品种、3个引进品种和1个培育品种共448个样品为研究对象。其中地方品种包括狼山鸡(30只)、仙居鸡(30只)、白耳鸡(30只)、茶花鸡(30只)、溧阳鸡(30只)、河南斗鸡(30只)、乌骨鸡(30只)、油鸡(30只)、丝羽乌骨鸡(30只)、坝上长尾鸡(29只)、河北柴鸡(22只)，引进品种包括隐性白羽肉鸡(30只)、科宝鸡(29只)、白来航鸡(30只)，培育品种为京星黄鸡(38只)。以上样本来自于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所和江苏家禽研究所。每只鸡采集翅下静脉血液1.5 mL，加0.3 mL抗凝剂ACD，置于2 mL离心管中-20 ℃保存。

1.2 基因组DNA提取

参考《分子克隆(第3版)》的方法提取基因组DNA[16]，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其纯度和浓度，用灭菌超纯水稀释为50 ng·μL-1，4 ℃保存备用。

1.3 SNP检测

对每个鸡品种制备2个DNA池作为模板，每个池随机混合10个样本的DNA，参考鸡IL-2全基因组DNA序列(GenBank登录号：AJ224516)，利用Premier 5软件设计覆盖全基因序列的4对引物(表1)，对每个DNA池进行PCR扩增用以筛选鸡IL-2基因的SNP位点。由于第3对引物扩增序列多态性最为丰富(包含5个SNPs)，用该对引物对15个群体共448个样本进行PCR扩增，进一步研究不同群体间IL-2基因的遗传多样差异。

表1 引物序列和扩增产物

Table 1 Information of primers sequences and PCR production

引物名称Name序列Sequence起始位置/bpStartposition片段长度/bpProductsize退火温度/℃AnnealingtemperatureIL-2-1F:GGCATTAAGACATACGGGR:AAATCAAAGGCAGAAGTG上游调控区-67～1126119352IL-2-2F:GTTTTCCTCTATCAGTTCTTTR:TTTTACAGTGGCAATCTTC806～2234142950IL-2-3F:GTACCCATACTCAAGGTCR:TGCATTCACTTCCGGTGT2048～3248120153IL-2-4F:CCTGGGAGAAGTGGTTACR:TGGTTTGGGATTCTTTCG2700～下游调控区92121155

PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火温度退火30 s，72 ℃延伸45 s， 35个循环；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。 PCR产物经1%琼脂糖电泳检测送公司测序。

1.4 统计分析

用Mega 4.0软件分析DNA序列的变异位点，确定等位基因；用Excel计算等位基因频率；用SPSS软件对各群体等位基因频率分布差异进行卡方检验；用Genepop软件包对每个位点进行Hardy-Weinberg(H-W)平衡检测以及观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、有效等位基因数(NE)等群体遗传学指标；用PIC_CALC软件计算各位点的多态性信息含量(PIC)；用Phase 2.0软件对研究个体进行单倍型分析。

2 结 果

2.1 DNA提取与PCR扩增

将所提取的每个样品的基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶检测，DNA质量较好并且比较完整，能够满足后续试验要求。用分光光度计对各基因组DNA进行定量检测，并根据检测结果将其浓度调整到50 ng·μL-1左右备用。利用所设计的4对引物，以制备的DNA池为模板进行PCR扩增，产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测都有较好的效果，与预计的扩增片段大小一致，且没有非特异性扩增条带出现(图1)，各位点的PCR产物适合进行测序分析。

1～4.IL-2-1～IL-2-4扩增产物；M.DNA相对分子质量标准1-4．PCR products of IL-2-1-IL-2-4 primers；M.DNA marker图1 IL-2基因4对引物的PCR扩增产物Fig.1 PCR products for 4 primers of IL-2

2.2IL-2基因SNP鉴定

结合DNA池和直接测序方法，在鸡IL-2 基因上共检测到13个SNPs，其位置信息、突变方式及基因结构上的分布见表2。其中SNP1、SNP2、SNP3、SNP8和SNP13位于外显子上，其余SNPs位点位于内含子上。位于外显子上的SNPs中，SNP1与SNP2为非同义突变，分别引起第27位丙氨酸突变为缬氨酸和第29位精氨酸突变为甘氨酸，另外3个SNPs(SNP3、SNP8和SNP13)为同义突变。就4对引物扩增序列上SNPs的分布密度而言，引物3包含5个突变位点，扩增序列多态性最为丰富，分别为SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10，表明该区域多态性最为丰富。因此，本研究接下来将重点关注引物3扩增区域在所有样本中的遗传变异情况。

表2 鸡IL-2基因13个SNPs的信息

Table 2 The information of 13 SNPs of chickenIL-2 gene

项目ItemSNP1SNP2SNP3SNP4SNP5SNP6SNP7SNP8SNP9SNP10SNP11SNP12SNP13位置/bpPosition7337387941002100825672582279928532890299630913813突变MutationC/TA/GC/TT/CT/CC/TA/GT/AT/CG/TC/AG/TA/G分布DistributionExon1Exon1Exon1Intron2Intron2Intron2Intron2Exon3Intron3Intron3Intron3Intron3Exon4

位置信息参考序列GenBank登录号：AJ224516

SNPs numbered in relation to DNA nucleotide positions(GenBank accession No.：AJ224516)

2.3 5个位点的等位基因频率与H-W平衡检测

用第3对引物对15个鸡品种的448个样品进行扩增，获得所有个体5个SNPs(SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10)的基因型数据，并统计各群体各位点的等位基因频率，结果如表2所示。可以看出，15个鸡群体的5个位点都发生了突变。SNP1位点在除了狼山鸡以外的其他品种中，T等位基因均为优势等位基因，尤其是在京海黄鸡、白耳鸡、茶花鸡和丝羽乌骨鸡中，T等位基因占有绝对优势，等位基因频率均在90%以上；SNP2位点在各群体中的等位基因频率与SNP1位点完全一致或接近，表明这2个位点在所有群体中可能都处于紧密连锁状态；SNP3位点在不同群体中基因型频率分布不同，其中京海黄鸡群体突变率最低，最小等位基因频率(等位基因T)为0.118；SNP4位点的T等位基因在大多数鸡群体为优势等位基因，而在3个中国地方品种(白耳鸡、乌骨鸡和油鸡)、1个引进品种(隐性白羽鸡)和京海黄鸡中，该等位基因频率较C等位基因频率低；SNP5位点在各群体中等位基因频率与SNP4位点完全一致或接近，表明SNP4和SNP5位点在所有群体中可能都处于紧密连锁状态。卡方检验表明，所有位点的2个等位基因在15个鸡群体中分布有极显著差异(表3)。同时，将15个鸡群体按照品种来源归为中国地方品种、引进品种和培育品种，进行卡方检验，结果表明所有位点的2个等位基因在这3个类群中的分布也有极显著差异(表3)。但由于各位点优势等位基因在3个鸡群体中没有明显的分布规律，因而不能确定哪个等位基因可能与较强的免疫能力有关。

H-W平衡检测表明，所有群体的5个位点都处于H-W平衡状态(P>0.05)。

2.4 5个位点的群体遗传学指标分析

表4展示了各个群体5个位点的观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、有效等位基因数(NE)和多态信息含量(PIC)等群体遗传学参数的平均值。可以看出，乌骨鸡的观测杂合度最高，为0.553，而京星黄鸡观测杂合度最低,为0.195。比较而言，溧阳鸡、河南斗鸡、丝羽乌骨鸡、坝上长尾鸡、科宝鸡和白来航鸡观察杂合度低于期望杂合度，表明群体中纯合子个体较多；而其他群体观察杂合度都接近期望杂合度，说明这些群体受外来选择及近交等因素的影响较小。有效等位基因数(NE)是反映群体遗传变异的一个重要指标[17]，结果表明，京星黄鸡有效等位基因数接近1，表明该鸡品种突变率较低，变异度小，而其他品种接近于2，表明这些群体5个位点的2个等位基因在群体内分布较为均匀；多态信息含量分析表明，京星黄鸡处于低度多态(PIC<0.25)，而其他品种则为中度多态(0.25

2.5 单倍型分析

利用Phase 2.0软件包对15个不同鸡群体进行单倍型分析，共得到23种单倍型(表5)， 表明所研究鸡群体丰富的多样性。其中单倍型H9在群体中的频率最高，为15.7%；而单倍型H20和H22在所有群体中频率仅为0.1%。从表5中可以看出，频率最高的单倍型H9，被8个中国地方鸡群体共享，这8个鸡群体分别为狼山鸡、仙居鸡、茶花鸡、溧阳鸡、河南斗鸡、丝羽乌骨鸡、坝上长尾鸡和河北柴鸡，而引进品种中，只在白来航鸡群体中检测到，培育品种中不存在该单倍型。单倍型H13被3个中国地方鸡品种(白耳鸡、油鸡和坝上长尾鸡)和2个引进品种(科宝鸡和白来航鸡)所共享；而单倍型H5在中国地方鸡品种(狼山鸡、仙居鸡、茶花鸡、溧阳鸡和河北柴鸡)、2个引进品种(隐性白羽鸡和白来航鸡)以及培育品种京海黄鸡中都有分布。

表5 单倍型频率

Table 5 Frequency of haplotypes

单倍型Haplotype位点Loci样本数Samplenumber频率FrequencyH1CAACG420.047H2CAATT240.027H3CATTT20.002H4CGACT290.032H5CGATG950.106H6TATCG210.023H7TATTT690.077H8TGTCG480.054H9TGTTG1410.157H10TGTCT700.078H11TATCG910.102H12CGACG280.031H13TGTTT960.107H14CAATG420.047H15CAACG440.049H16CATCG20.002H17TGACG20.002H18TATTG350.039H19CGATT80.009H20CATCG10.001H21CGTTG20.002H22TGATG10.001H23TAACT30.003

另外，从表6中可以看出，单倍型H1、H2、H3、H4、H6、H16、H17、H19、H20、H21为中国地方鸡品种特有的单倍型，在引进品种和培育品种中不存在。其中，单倍型H1、H2、H4和H16均在4个及以上地方品种中检测到；同时，单倍型H9和H11虽不是中国地方鸡品种所特有，但其只在某个引进品种少数样品中检测到。因此，单倍型H1、H2、H4、H9、H11及H16很有可能与中国地方鸡品种较强的免疫能力相关。而单倍型H22和H23为引进品种所特有，但单倍型频率都很低。

3 讨 论

P.Kaiser等[11]通过研究8个自交系的白来航鸡，发现鸡的IL-2基因中长为517 bp的启动子区域的序列和它的4个外显子均没有变异。陈吉刚等[12]克隆了丝羽乌骨鸡的IL-2 基因，与Kestrel、Obese和SC品系的来航鸡相比发现，不同品系鸡IL-2 其编码氨基酸在15、28、30、32和 133位发生了改变。王彦彬等[13]克隆了固始鸡IL-2基因的cDNA序列，与已发表的序列相比发现了2个核苷酸变异。黄溢泓等[14]克隆了广西10个地方品种鸡IL-2 基因的cDNA序列，发现不同品种鸡编码氨基酸在第60位、第127位、第132位、第138位、第192位、第204位、第256位和第457位发生改变。本研究在15个鸡群体中共检测到13个SNPs(表2)，表明鸡IL-2的遗传变异非常丰富，这是为了适应多样化的生存环境经受的选择作用的结果。而本研究检测到的位于第27位(SNP1)和第29位(SNP2)氨基酸序列的两个非同义突变位点在以往的研究中没有报道过，因此，为鸡IL-2 基因的研究提供了新的重要的遗传变异资源。同时，本研究发现了8个位于鸡IL-2 基因内含子上的突变位点。事实上，内含子具有促进或抑制基因表达[18-19]的作用，因此对基因功能有重要的影响。笔者前期通过比对GenBank上的2个鸡的IL-2基因组DNA序列，发现内含子中存在插入缺失位点，该位点可以将这2个DNA序列划分为2个分支[20]，也说明了对不同遗传背景鸡群IL-2基因内含子研究的必要性。另一方面，从群体水平上对鸡IL-2基因的研究也尚未见报道。

基于以上背景，以15个鸡群体的448个样品为实验对象，对所发现的IL-2 基因的包含5个SNPs位点(SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10)的高变异区域的遗传多样性进行了研究。这5个突变位点中的2个位点位于内含子2上(SNP1和SNP2)，1个位点位于外显子3上(SNP3)，另外2个位点位于内含子3上(SNP4和SNP5)(表2)。等位基因频率分布结果显示，除狼山鸡以外，SNP1(T>C)和SNP2(G>A)位点在所有鸡群体中优势等位基因分布大致相同，可能是由于对狼山鸡某一性状的选育造成的这2个位点受到人工选择的影响导致的，也有可能是品种形成之初等位基因的分布就是这样的。而另外3个SNP位点在不同群体中等位基因频率分布及优势等位基因分布差异较大，反映了不同鸡群生长环境和选育程度的不同。

表6 23种单倍型在15个群体中的分布

Table 6 The distribution of 23 haplotypes in 15 populations

单倍型Haplotype群体PopulationLSXJBECHLYHNDWGYJSYWGBSCWHBCYXBYKBBLHHH122000080011100000H2100606009200000H3200000000000000H41000061602220000H52170414000005220229H64013000300100000H715005000001190038H81605011004616404H9119026929002812140030H100507476244203260H1102011518200121148000H12041080000130605H13003000002808002640H1400700001304006120H1500301001604011360H16000200000000000H17000001000010000H180000002700100070H19000000800000000H20000000010000000H21000000000110000H22000000000001000H23000000000003000

杂合度、有效等位基因数、多态信息含量等群体遗传学指标是衡量遗传多样性鸡变异水平的指标。本研究发现15个群体5个位点的平均期望杂合度在0.177～0.481波动，其中坝上长尾鸡的期望杂合度最高，而京星黄鸡期望杂合度最低。杂合度越高说明品种的遗传多样性越丰富，相反，京星黄鸡是用地方品种资源为育种素材，经世代闭锁繁育形成的培育品种，有效群体及遗传变异有限，遗传血统狭窄，因此杂合度较低。另一方面，溧阳鸡、河南斗鸡、丝羽乌骨鸡、坝上长尾鸡、科宝鸡和白来航鸡观察杂合度低于期望杂合度，表明群体中纯合子个体较多，说明这些群体中存在一定程度的近交；还可能与长期对某一性状进行选择，造成整体遗传背景趋向单一相关；也可能由于群体历史因素如瓶颈效应或奠基者效应等造成的基因纯合较多现象。另外，有效等位基因数和多态信息含量分析也证明了京星黄鸡的突变率较低，2个指标在京星黄鸡中分别为0.124和0.158。

SNP位点通过单倍域的形式遗传给后代，单倍域内全部的SNP类型被称为单倍型[21]。以往的研究表明，根据单倍型可以有效的鉴定可能与疾病相关的变异[22]。本研究在15个鸡群体中共发现23种单倍型(表5)，其中京星黄鸡仅含有H5、H7、H8、H12 4种单倍型，其他鸡群体中出现的单倍型种类为5～14个不等，以坝上长尾鸡最多，表明这些鸡种较培育品种鸡具有更广阔的选育空间。同时，在地方品种鸡特有的单倍型中，单倍型H1、H2、H4和H16为多个鸡群所共享，而单倍型H9和H11只在某个引进品种的少数样品中检测到，其余全部分布在地方品种中(表6)。一般认为，地方鸡群体在品种形成过程中人工选择干预的强度较小，因此其适应自然环境的能力和抗逆性较强；而引进品种和培育品种在现代高强度的选择选育过程中，对人工环境较为依赖，因而抗逆性稍差。因此，以上6种地方品种中优势的单倍型(H1、H2、H4、H9、H11和H16)可能与疾病抵抗能力相关。

4 结 论

本试验对IL-2基因的SNP进行了筛选并研究了5个SNPs位点在11个中国地方鸡品种、3个引进鸡品种和1个引进鸡品种中基因频率分布，以及各群体平均观察杂合度、平均期望杂合度、平均有效等位基因数、平均多态信息含量等群体遗传学指标，并对各个样品的单倍型进行推导，研究单倍型在不同群体中的分布。笔者发现IL-2基因在不同鸡群体中多样性有明显差异，可作为抗病基因素材，同时，H1(CAACG)、H2(CAATT)、H4(TGTTG)、H9(TGTTG)、H11(TATCG)和H16(CATCG)可能与疾病抵抗能力相关。

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(编辑 郭云雁)

Genetic Diversity ofIL-2 Gene in 15 Chicken Populations

ZHAO Hui-jing，ZHANG Jing-jing,WEN Jie,LIU Ran-ran, ZHENG Mai-qing,LI Qing-he,MA Yue-hui,ZHAO Gui-ping*

(InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

To deeply study the genetic diversity of chicken Interleukin 2 (IL-2) gene and provide a theoretic basis for the breeding for disease resistance，the genetic variation ofIL-2 were studied in 448 individuals from 11 Chinese native，3 introduced and one cultivated chicken breeds by DNA sequencing method in this study.A total of 13 SNPs were identified by using DNA-pooling and sequencing.The results of analysis for a genome region including 5 single nucleotide polymorphisms(SNPs) among all the individuals showed that the frequencies of different alleles differed significantly among 15 populations，suggestingIL-2 had abundant genetic variations and provided promising gene resource for disease resistance.Analysis of several population genetic indexes indicated that the Jingxing Yellow chicken had the lowest level of genetic diversity,which was consistent with its breed formation and little differences of genetic diversity were observed among other breeds.Analysis of haplotypes revealed a total of 23 hapltoyepes.Among them，H1(CAACG)，H2(CAATT)，H4(TGTTG)，H9(TGTTG)，H11(TATCG) and H16(CATCG) were unique or dominant in Chinese native chicken breeds，suggesting these haplotypes may be associated with the disease-resistant ability.

chicken；IL-2 gene；genetic diversity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.006

2014-06-09

中央级公益性科研院所基本科研业务费项目(2012cj-5)；中国农业科学院创新工程(ASTIP-IAS04)

赵会静(1978-)，女，河北石家庄人，助理研究员，硕士，主要从事畜禽遗传资源分析研究，Tel：010-62815891，E-mail：zhhj1998927@163.com

*通信作者：赵桂苹，研究员，E-mail:zhaoguiping@caas.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)01-0041-09