长链非编码RAN ENST00000447336在氧化型低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤中的表达*

西安市第一医院心内科(西安710002)

刘佩勇 谢 梅 纪玉强# 赵 朝▲ 程曼丽

·论著·基础研究·

长链非编码RAN ENST00000447336在氧化型低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤中的表达*

西安市第一医院心内科(西安710002)

刘佩勇 谢 梅 纪玉强#赵 朝▲程曼丽

目的：检测长链非编码RAN (lncRNA) ENST00000447336在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的表达水平。方法：采用实时定量RT-PCR法检测ox-LDL诱导的损伤HUVEC与正常HUVEC中lncRNA-ENST00000447336表达水平。结果：ox-LDL诱导的损伤HUVEC中lncRNA-ENST00000447336水平(0.65±0.17)明显高于正常HUVEC中lncRNA-ENST00000447336水平(0.29±0.11)，二者比较差异具有统计学意义。结论：损伤的人脐静脉内皮细胞中lncRNA-ENST00000447336水平增高，lncRNA-ENST00000447336可能参与了血管内皮细胞损伤过程。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，不编码蛋白但可以调控基因的表达水平，参与了细胞增殖、分化、凋亡等生理过程，同时与多种疾病病理过程密切相关[1-3]。近年来研究发现lncRNA参与了心脏、血管的生长和分化，与动脉粥样硬化性心脏病、心力衰竭、扩张性心肌病及强直性肌营养不良性心脏病等有关[4-9]。我们前期研究[10]利用Human lncRNA芯片比较氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作用后的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)和正常HUVEC的lncRNA和mRNA表达水平，筛选出了HUVEC损伤相关的lncRNA，其中lncRNA ENST00000447336增高12倍，为进一步验证芯片实验结果，我们采用实时定量RT-PCR法检测ox-LDL诱导的损伤HUVEC与正常HUVEC中lncRNA-ENST00000447336表达水平，为研究lncRNA参与血管内皮细胞损伤的机制提供实验依据。

材料与方法

1 细胞与材料 HUVEC-12内皮细胞购自中国科学院上海研究所细胞库，Trizol液(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)，定量PCR试剂(大连宝生物工程有限公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养：取HUVEC细胞适量接种于含DMEM培养基(内含10%胎牛血清，青、链霉素各100 U/ml)中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换半液，生长至融合状态，倒置显微镜下观察细胞呈单层铺路石状镶嵌排列，待细胞融合达 80%以上进行细胞传代。当细胞融合达60%～70%时加入ox-LDL(终浓度100 mg/L)继续培养24h后收集细胞。

2.2 细胞总RNA的提取：取1×106个细胞，完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol液提取细胞总RNA，严格按照试剂说明书进行操作。使用Nanodrop-1000分光光度计测定RNA在260nm、280nm和230nm的吸收值，计算RNA浓度并评估纯度，使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。

2.3 cDNA合成：采用逆转录试剂盒进行cDNA合成，1.5 μg RNA、0.5μl 引物(10μM) 、 3.2μl dNTPs Mix(1.25mM)、加无RNA酶的H2O至总体积14.5 μl，混匀后在65℃水浴5min，冰上放置2 min。短暂离心后，在离心管中依次加入4 μl RT反应液5X First-Strand Buffer 、1μl 0.1 M DTT、0.3 μl RNase Ihibitor、0.2 μl SuperScript III RT混合后37℃恒温1 min，50℃温育60 min，70℃ 温育15 min后-20℃保存。

2.4 实时定量PCR检测lncRNA-ENST00000447336的表达：利用Primer 5.0软件设计合成ENST00000447336及内参GAPDH引物序列，ENST00000447336上游引物5'-TCACTTCCTCCATTTATGTTTCC-3'，下游引物5'-AACAATATGCAGCGACTGTGAAG-3'，产物长度79bp；GAPDH上游引物5'- GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物5'- GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'，产物长度299bp。10μl PCR反应体系包括：5 μl 2 × Master Mix、0.5μl 10μM 的PCR上游引物、0.5μl 10μM 的PCR下游引物及2μl cDNA，反应条件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60℃ 60 s共35个循环。扩增结束后得到循环阈值即Ct值，每个样本设置三个复孔。基因表达水平采用2-△△CT进行分析，ΔΔCt =实验组ΔCt (目的基因Ct-内参基因Ct)-对照组ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct) 。

结 果

1 RNA样本质量分析 细胞总RNA 的OD260/280比值在1.8～2.0之间，OD260/230比值大于1.8，所有样本的 RNA 质量均满足检测要求，RNA电泳结果显示电泳显示5S、18S、28S条带清晰，28S条带的亮度大约是18 S的两倍，证实从细胞提取的RNA完整性好，无降解，见附图。

附图 RNA样本电泳

2 lncRNA-ENST00000447336在ox-LDL诱导的损伤HUVEC中的表达水平 实时定量PCR结果显示ox-LDL诱导的损伤HUVEC中lncRNA-ENST00000447336水平为(0.65±0.17)，明显高于正常HUVEC中lncRNA-ENST00000447336水平(0.29±0.11)，二者比较差异具有统计学意义(t=4.355，P=0.001)。

讨 论

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是动脉硬化的血管病中最常见、最重要的一种，是多种心脑血管疾病的共同病理基础，严重威胁着人们的健康。其发病机制尚未完全清楚，曾有多种学说从不同角度来阐述，包括脂质浸润学说、血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说等。近年来多数学者支持“内皮损伤反应学说”，认为各种主要危险因素最终损伤动脉内膜，而粥样硬化病变的形成是动脉对内皮、内膜损伤做出的验证-纤维增生性反应的结果。血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VEC)的损伤和功能障碍是AS发生和发展的始动因素和中心环节之一[11-12]。由于VEC损伤和功能障碍是启动As事件，从保护VEC的形态及功能这一新的角度研究新型有效的抗AS的方法，对于AS疾病的防治具有良好的发展前景及临床使用价值。

lncRNA是在小鼠全长cDNA文库大规模测序时首次被提出来[13]，是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平，根据lncRNA与蛋白编码基因的相对位置关系可分为正义型、反义型、内含子型、双向型及基因间型五种类型[14-15]。目前研究表明，lncRNA参与了调控机体的生长发育、细胞增殖、分化与凋亡等生理过程，与肿瘤、感染性疾病及神经系统疾病密切相关[1-3]。近年来国内外学者研究证实lncRNA也参与了心脏的发育及动脉粥样硬化性心脏病、心力衰竭、扩张性心肌病及强直性肌营养不良性心脏病等过程。lncRNA-ANRIL(Antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL)即 INK4 基因座上的反义非编 RNA，位于染色体 9p21 区域 ；一项大规模的病例对照研究示 ANRIL 基因携带者较非携带者显著增加心肌梗死的患病风险[16]。另外一项大规模病例-对照研究发现lncRNA- MIAT (Myocardial infarction-associated transcript，MIAT)基因的6个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点与心肌梗死密切相关[17]。Tie-1(表皮生长因子等位基因 1)的反义RNA 属于长链非编码 RNA，可以与Tie-1 mRNA结合，下调Tie-1的表达水平，而Tie-1是细胞表面酪氨酸激酶的一种受体，对胚胎发育中内皮细胞的生长发育有重要意义。为了进一步研究lncRNA在动脉粥样硬化中的作用，我们前期实验[10]利用Human lncRNA Array芯片比较ox-LDL作用后的HUVEC和正常HUVEC的lncRNA和mRNA表达水平，筛选HUVE损伤相关的lncRNA。结果发现，相对于正常HUVEC，在ox-LDL 诱导损伤HUVEC表达上调和下调超过 2 倍的 lncRNA和mRNA有 139 种和113种，lncRNA上调和下调超过 4 倍的分别有 30 种和 8 种，mRNA上调和下调超过 4 倍的分别有 21 种和 7 种，其中lncRNA-ENST00000447336增高12倍，但芯片实验结果需要进一步验证。我们采用实时定量RT-PCR技术检测lncRNA-ENST00000447336在ox-LDL 诱导损伤HUVEC中的表达水平，结果显示ox-LDL诱导的损伤HUVEC中lncRNA-ENST00000447336水平明显高于正常HUVEC中lncRNA-ENST00000447336水平，这与芯片实验结果基本一致。lncRNA-ENST00000447336来源于Ensembl数据库，长度333个核苷酸，定位于Chromosome 7: 103，030，104-103，031，354，其在血管内皮细胞损伤中的具体作用有待于进一步研究。

综上所述，芯片实验及实时定量PCR技术均证实lncRNA-ENST00000447336在示ox-LDL诱导的损伤HUVEC中高表达，可能与血管内皮细胞损伤过程有关，随着对lncRNA的研究深入将为为血管内皮细胞损伤机制的研究提供新的实验数据。

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(收稿：2015-06-30)

Expression of long noncoding RNA ENST00000447336 in oxidized low-density lipoprotein induced vascular endothelial cell Department of Cardiovascular Medicine，First Hospital of Xi’an

(Xi’an 710002)

Liu Peiyong Xie Mei Ji Yuqiang et al

Objective: To detect the expression long noncoding RNA (lncRNA)ENST00000447336 in oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) induced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) compared with normal HUVEC. Methods: The expression level of lncRNA-ENST00000447336 in ox-LDL induced HUVEC was detected by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: Compared with normal HUVEC(0.29±0.11)，the expression level of lncRNA-ENST00000447336in ox-LDL treated HUVEC(0.65±0.17) was statistically higher. Conclusion: The expression level of lncRNA-ENST00000447336in ox-LDL induced HUVEC increased. lncRNA-ENST00000447336may be involved in the damage of HUVEC.

RNA,Long noncoding Endothelium,vascular Endothelial cells @Oxidized low-density lipoprotein

*国家自然科学基金资助项目(81470550)

RNA，长链非编码 内皮，血管 内皮细胞 @氧化型低密度脂蛋白

R364.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.001

教育部科学技术研究重点项目(212170)

#西安医学院第一附属医院

▲西安交通大学第一附属医院