布地奈德对哮喘大鼠气道重塑及气道平滑肌中Toll样受体4表达的影响

西安市中心医院呼吸内科(西安710003) 黄妙毅 杜旭升

布地奈德对哮喘大鼠气道重塑及气道平滑肌中Toll样受体4表达的影响

西安市中心医院呼吸内科(西安710003) 黄妙毅 杜旭升

目的：探讨布地奈德对哮喘大鼠模型气道重塑及平滑肌中Toll样受体4表达的影响。方法：将30只SPF级SD大鼠随机分为支气管哮喘组(A组)、健康对照组(B组)、布地奈德治疗组(C组)3组，每组10只。制备大鼠肺组织病理切片，HE染色后观察各组气道结构改变情况，并测定支气管壁厚度(WAt/Pi)、支气管壁平滑肌厚度(WAm/Pi) 及支气管平滑肌细胞核数(N/Pi) ，利用Western-Blot方法检测气道平滑肌中TLR4的蛋白表达。结果：光镜下可见A组支气管上皮细胞脱落、管壁炎症细胞浸润、杯状细胞增生、基底膜和平滑肌明显增厚，而C组上述改变较A组明显减轻。与B组比较，A组支气管管壁厚度、平滑肌厚度及平滑肌细胞核数显著升高(P<0.01)，与A组比较，C组支气管管壁厚度、平滑肌厚度及支气管平滑肌细胞核数显著降低(P<0.01)。A组的TLR4的蛋白水平明显高于B组及C组(P<0.01)。结论：吸入布地奈德可以防治气道重塑，可能通过抑制TLR4的表达实现。

气道重塑是除气道慢性炎症以外支气管哮喘的又一重要特征，是难治性哮喘的重要因素，近些年越来越受到人们的重视，气道重塑病理表现为气道上皮破坏、杯状细胞增生、上皮下胶原沉积及气道平滑肌增殖等，它已经成为哮喘肺功能进行性下降和难治性哮喘的病理学基础之一[1]。研究表明：Toll样受体(Toll like receptor，TLR)可通过调节多种致气道重塑因子的生成和活化，参与气道重塑的形成[2]。布地奈德是临床治疗哮喘常用药物，其抗炎作用明确，但对气道重塑的作用及其机制目前报道不多。本研究将建立哮喘动物模型，探讨早期布地奈德治疗对哮喘气道重塑以及哮喘气道平滑肌中TLR4表达的影响。

材料与方法

1 动物与材料 SPF级SD大鼠(雄性，鼠龄6～8周，200～250g),由第四军医大学实验动物中心提供；布地奈德(批号LOT309973，1mg/ 2ml，阿斯利康公司生产)；V级鸡卵白蛋白 (OVA，美国Sigma公司)；兔抗大鼠TLR4单克隆抗体(美国Imgenex公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(武汉博士德公司)。

2 实验方法

2.1 动物分组与模型建立[3]： 将30只SPF级SD大鼠随机分为支气管哮喘组(A组)、健康对照组(B组)和布地奈德治疗组(C组)，每组10只。A组：分别于第1天及第8天给每只大鼠皮下注射卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)10mg和氢氧化铝凝胶200mg (混合于1ml的PBS缓冲液中)，并同时腹腔注射灭活百日咳杆菌5×109个。于第15天开始激发：将大鼠放置于一个密闭的容器中，用超声雾化器给予50 ml 2%卵清白蛋白磷酸盐缓冲液，行雾化吸入刺激，每天1次，每次雾化30 min。持续时间6周。B组：对照组则以磷酸盐缓冲液代替致敏原于第1及第8天行皮下注射，用生理盐水代替卵清白蛋白每日雾化吸入。C组：致敏及OVA雾化程序同A组，从第1次激发起，每日激发前30min每只大鼠每日吸入布地奈德雾化溶液 (1 mg/2 ml )，每次雾化5 min，持续时间共6周。

2.2 标本的制备：上述各组动物于末次雾化吸入24 h后行颈椎离断处死，剥离大鼠右肺，分离其气道平滑肌，即刻冻存于-80℃冰箱，用于Western-Blot检测，用4%多聚甲醛6 ml灌注固定左肺气管，放置于4%多聚甲醛中保存，石蜡包埋，切片经苏木精-伊红(HE)染色行病理学观察。

2.3 气道壁厚度的测定： 参照文献[4]方法将待测切片放在显微镜下放大400 倍，该显微镜连接计算机，在镜下找到肺内支气管横断面，随机选取每只大鼠直径100～200μm完整的小支气管横截面5 个，采用LeikaQ 500分析系统测定支气管管腔周长(Pi)、支气管管壁面积(WAt)、支气管平滑肌面积(WAm) 及支气管壁平滑肌细胞核数量(N)，并用Pi进行标准化，分别表示支气管壁厚度(WAt/Pi)、支气管壁平滑肌厚度(WAm/Pi)及支气管壁平滑肌细胞核数量(N/Pi)。

2.4 Western -Blot检测气道平滑肌中TLR4蛋白的表达[5]：支气管平滑肌放入匀浆器中分散后用蛋白裂解液提取支气管平滑肌总蛋白，测定样本蛋白浓度，分装后放置于-80℃冰箱保存、待测。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离TLR4蛋白，应用半干式电转移仪进行蛋白转膜，转膜后用兔抗鼠TLR4抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG进行抗体孵育及显色处理，等待蛋白条带颜色深度适当，再用PBS漂洗，将滤膜用GBOX HR凝胶成像分析系统进行扫描并读取各条带的A值。

结 果

1 肺组织HE染色 光镜下观察结果显示：A组气道壁及气道平滑肌明显增厚，黏膜皱褶增多，黏膜下层明显增宽，管腔狭窄明显，有时管腔内可见黏液栓堵塞，气道上皮细胞可见脱落，杯状细胞增多，管周及黏膜下可见大量炎性细胞浸润。B组未见炎症反应，肺组织形态正常。C组上述改变与A组比较明显减轻。

2 支气管壁厚度、支气管平滑肌厚度及支气管平滑肌细胞核数量的比较 见表1。A组WAt/Pi、WAm/Pi及N/Pi均高于B组(P<0.01)，C组均低于A组(P<0.01)，但布地奈德治疗组高于对照组(P<0.01)。

3 Western-Blot检测气道平滑肌中TLR4的蛋白水平 见表2。A组的TLR4的蛋白水平明显高于B组及C组(P<0.01)。

表1 各组大鼠WAt/Pi、WAm/Pi和N/Pi的比较

注：*与B组比较，P<0.01；#与A组比较，P<0.01

表2 各组大鼠气道平滑肌中TLR4蛋白表达水平比较±s)

注：*与B组比较，P<0.01；#与A组比较，P<0.01

讨 论

支气管哮喘是一种气道炎症性疾病，随着病程的迁延和气管炎症的进展，大部分患者会发生气管重塑，气管重塑是哮喘不可逆性改变的重要原因之一，近期有研究发现：气管炎症与重塑同步发生[6]，也就是说哮喘早期阶段就存在了气管重塑，这就突出了抑制气管重塑在控制哮喘方面的重要性。而近端支气管内的气管平滑肌细胞增多是气管重塑的重要特征之一。TLR是一个新发现的高度保守而古老的天然免疫受体家族，它介导固有免疫和获得性免疫[7]，国外的研究报道TLR4在气管平滑肌细胞中表达[8，9]。Graaf等证实[10]：激活TLR4可以促进血管平滑肌细胞的增殖，而气管平滑肌细胞与血管平滑肌细胞同属于平滑肌细胞，细胞结构和形态功能可能有相似之处。本研究结果显示：哮喘组TLR4的蛋白水平显著高于对照组，它与支气管壁厚度、支气管壁平滑肌厚度、支气管壁平滑肌细胞核数量在大鼠气管中的变化趋势一致。因此，我们推测TLR4可能在哮喘气管增厚加重气管重塑中起作用，但其机制有待进一步探讨。

布地奈德是临床广泛应用的治疗哮喘的吸入型糖皮质激素，Chen和Khalil研究发现[11]地塞米松可以抑制体外培养的牛气管平滑肌细胞的增殖，进而减轻气管重塑。本研究发现：C组其平滑肌厚度较A组明显降低，提示早期应用布地奈德吸入可抑制平滑肌厚度的增加，其气管壁总厚度较A组也明显降低，提示布地奈德对改善气管重塑具有积极的作用。布地奈德治疗组气管平滑肌中TLR4蛋白表达与哮喘组比较明显下降。因此推测布地奈德可能通过下调TLR4的表达改善气管重塑。

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[11] Chen G,Khalil N.TGF-β1increases proliferation of airway smooth muscle cells by phosphorrylation of map kinazes[J]．Respir Res,2006,7(1):2．

(收稿：2014-12-10)

致 作 者

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陕西医学、陕西中医杂志社

Effect of Budesonide on airway remodeling and TLR4of airway smooth muscle cell in rat models of asthma

Department of Respiratory Disease，Xi’an Central Hospital (Xi’an 710003)

Huang Miaoyi Du Xusheng

Objective:To explore the influence of budesonide on the airway remodeling and TLR4of airway smooth muscle cell in Rat models of asthma. Methods:Thirty SD rats were randomly divided into 3 groups:model group(group A)，normal control group(group B),budesonide treatment group(group C)，with 10 rats in each group.The airway inflammation and the alteration of airway structure were detected by HE staining, The airway wall thickness(WAt/ Pi),the bronchial smooth muscle thickness(WAm/Pi)and numbers of smooth muscle cell (N/Pi )were measured by using image analysis system. the expression of TLR4protein in cells were detected by Western blot.Results:Bronchial epithelial desquamation,inflammatory cell infiltration,hyperplasia of goblet cells and smooth muscle cells were seen in group A under optical microscope,however compared with group A,the manifestations were significantly decreased in group C.Compared with group B,WAt/ Pi , WAm/Pi and N/Pi were expressed at higher levels in lung tissues of group A(P<0.01). Compared with group A,WAt/ Pi ,WAm/Pi and N/Pi were expressed at lower levels in lung tissues of group C(P<0.01). Compared with group B and C,the expression of TLR4at protein levels in group A was significantly highter. Conclusion：The airmay remodeling can be inhibited by budesonide probably through reducing the expression of TLR4.

Asthma/drug therapy Asthma/physiopathology Budesonide/therapeutic use Models,animal Rats

哮喘/药物疗法 哮喘/病理生理学 布地奈德/治疗应用 模型，动物 大鼠

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.004