乌骨鸡黑色素细胞体外原代培养及鉴定

韩德平，王书祥，张媛媛，杨 祖，李俊英，邓学梅

(中国农业大学动物科技学院，畜禽遗传改良北京市重点实验室，北京 100193)

乌骨鸡黑色素细胞体外原代培养及鉴定

韩德平，王书祥，张媛媛，杨 祖，李俊英，邓学梅*

(中国农业大学动物科技学院，畜禽遗传改良北京市重点实验室，北京 100193)

旨在建立乌骨鸡黑色素细胞体外培养和鉴定的方法，为研究黑色素细胞功能提供理想的生物材料。本研究选取乌骨鸡腹膜组织，采用DispaseⅡ和胰酶-EDTA混合消化法，经严格控制不同培养阶段的消化时间，对黑色素细胞进行纯化和传代，获取了乌骨鸡黑色素细胞。通过观察各个培养阶段的细胞形态和细胞生长曲线，表明在专用培养基条件下，细胞增殖良好。根据细胞形态特征、电镜下的亚细胞结构、黑色素合成相关基因的表达分析、DOPA染色和细胞免疫化学染色鉴定，表明所获得的细胞符合黑色素细胞特征。细胞经传代后培养至第10代，仍保持了正常的生物学特性，说明所建立的培养体系可以实现乌骨鸡黑色素细胞体外原代培养。综上表明，本研究成功建立了乌骨鸡黑色素细胞体外分离培养体系。

乌骨鸡；黑色素细胞；原代培养；鉴定

丝羽乌骨鸡是我国珍贵的家禽品种，具有丝羽、乌骨、乌肉等特征[1]，因其传统的药用价值而备受关注[2]。人们普遍认为，乌骨鸡的药用价值主要源于其体内存在的大量黑色素[3]。研究发现，黑色素细胞广泛分布于乌骨鸡体内各组织器官，黑色素细胞分布和黑色素的合成在不同日龄的组织内存在差异，在气管、肺、睾丸、卵巢以及嗉囊等组织，黑度随日龄增长而逐渐加深；而腿肌和胸肌等组织的黑度却随着日龄增长而逐渐变浅[4]。骨膜和腹膜等结缔组织，无论在胚胎期还是生长发育期，都表现为大量的黑色素沉积。因此，选取骨膜和腹膜用于黑色素细胞的分离培养，是较好的选择。

黑色素细胞是黑色素的产生来源，完全分化的成熟黑色素细胞是一种带有许多长突起的伸长细胞[5]。乌骨鸡黑色素可以延长果蝇寿命，并有增强果蝇排铅解毒的能力[6]。人皮肤内黑色素合成过程中的副产物对细菌具有氧化杀伤作用[7-8]。在炎症条件下，皮肤角质细胞和白细胞释放的炎症介质会促进黑色素细胞合成黑色素和形成更多细胞突起[9-10]。除作为黑色素的合成场所以外，黑色素细胞还具有许多重要的功能。有研究表明，黑色素细胞在维持组织结构和损伤后免疫应答过程中发挥重要作用。最近的研究发现，组织损伤的局部环境会直接诱导黑色素细胞迁移至损伤部位[11]。在斑马鱼损伤试验中发现，早期迁移的免疫细胞通过释放信号分子，诱导黑色素细胞迁移至损伤部位，进一步通过细胞突起包裹外来物质[12]。另有资料报道，位于人内耳纹状体内的巨噬细胞样黑色素细胞，会通过调控紧密连接相关蛋白的表达来影响血管屏障的完整性，从而造成听觉障碍[13]。黑色素细胞的功能是多样的，其作用机制值得深入探讨。

乌骨鸡作为黑色素细胞及黑色素极为丰富的自然突变体，已成为相关功能研究的重要模型。目前，针对乌骨鸡黑色素细胞的分离培养方法虽有报道，但其培养效率还不够理想。本研究旨在建立乌骨鸡原代黑色素细胞体外分离培养体系，为研究乌骨鸡黑色素细胞生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

20胚龄乌骨鸡胚胎来自中国农业大学实验牧场。黑色素细胞培养基主要成分为人黑色素细胞生长添加物(HMGS，Gbico)，其中含有牛垂体提取物、胎牛血清、牛胰岛素、牛转铁蛋白、基本成纤维细胞生长因子、氢化可的松、肝素、佛波醇酯。

1.2 方法

1.2.1 黑色素细胞的原代分离培养 取孵化20 d的乌骨鸡蛋，酒精擦拭蛋壳表面，经紫外线照射消毒30 min。沿气室一侧敲破蛋壳，取出鸡胚，无菌剪取腹膜。经灭菌生理盐水清洗后，置于Medium 254(Gibco)中，用眼科剪剪碎组织。置于15 mL离心管中，加入适量蛋白酶(Dispase) Ⅱ酶(Roche)和胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(Gibco)，37 ℃消化15 min，加入胎牛血清，终止消化，反复吹打后经200目细胞筛过滤。1 000 r·min-1离心10 min，加入新鲜培养基吹打混匀。1 000 r·min-1离心10 min，加入含HMGS的新鲜培养基混匀，计数细胞，以2×105mL-1接种于细胞瓶中。置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，12 h后吸弃培养液，去除未贴壁的细胞和上清，以后每2 d换液1次。

1.2.2 黑色素细胞纯化与传代培养 观察培养瓶中细胞生长状况，至细胞达70%融合时，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液(Gibco)37 ℃消化7～10 min，镜下观察细胞消化状态。弃去消化液，加入灭菌PBS清洗后弃掉。再加入新鲜消化液消化5 min，弃掉消化液，此时只有含黑色素的细胞仍然贴壁细胞瓶，加入含人黑色素细胞生长添加物(HMGS，Gbico)的新鲜培养基Medium 254，继续置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每2 d换液1次。消化培养3次即可得到纯的黑色素细胞。传代培养时消化时间为10 min，1个25 mL细胞瓶传代2个25 mL细胞瓶。

1.2.3 黑色素细胞生长率的测定 取处于对数生长期的黑色素细胞，0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液消化，调整细胞浓度为4×104mL-1，按200 μL每孔接种于96孔板，于37 ℃、5% CO2培养箱培养。从接种24 h开始，每日随机取3个孔做细胞计数(CCK-8)比色试验，计算平均值，共计数14 d，未计数细胞每2 d换液1次。加入100 μL 10% CCK-8，继续培养4 h，自动酶标仪450 nm波长测吸光度值，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 RT-PCR及序列测定 取培养至第5代的细胞，接种于6孔板中，加入生长培养基培养。待细胞长至80%融合后，利用细胞RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取细胞总RNA，并反转录cDNA，根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank公布的相关序列设计引物(Primer Premier 5.0软件)，引物由北京生工生物技术有限责任公司合成，引物序列见表1。鉴定引物扩增特异性时，设置阴性对照，此时不加cDNA模板，其它条件一致。PCR产物由华大基因公司测序鉴定。

1.2.5 抗Microphthalmia(MITF)免疫细胞化学染色 取第5代处于对数生长期的黑色素细胞，调整细胞浓度为2×105mL-1，接种于6孔板，37 ℃、5% CO2培养箱培养2 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛液室温固定20 min。0.1% Triton X-100室温处理10 min，PBS洗2次。山羊血清封闭液室温作用20 min，吸弃封闭液，加入抗MITF(1∶2 000，Abcam)抗体,37 ℃作用1 h，PBS清洗3次。加入HRP标记抗小鼠二抗(1∶1 000，北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温作用1 h，PBS清洗3次。二氨基联苯胺(DAB)室温避光显色5 min。水溶性封片剂封片后，置于倒置显微镜下观察。阴性对照染色时用PBS替代一抗，经二抗作用后，DAB显色观察。

表1 引物序列

Table 1 Information of primer sequence for the genes

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence扩增片段长度/bpProductsizeMITFF:TGTCCCTTGTTCCATCC,R:ACATTTCCGAGGTTGTCAC204TYRF:TCAAGGACCCCAAGACTCCC,R:CGGAAGCTGTAATTGGCCATT106TRP-1F:GCTAAGAAGGTATTCGGCT,R:AGTGAGAAGAGGCTGATGC376KITF:CATCGGTGCCATCCTTTGAG,R:CTTGTCACCATTGCTGGATGC110

1.2.6 多巴染色鉴定 取第5代处于对数生长期的黑色素细胞，调整细胞浓度为2×105mL-1，接种于6孔板，37 ℃、5% CO2培养箱培养2 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛液室温固定20 min。PBS清洗后，加入3，4-二羟基-L-苯丙氨酸孵育液(DOPA，Sigma-Aldrich；1L PBS中含1.104 g DOPA)，37 ℃孵育30 min。更换新的DOPA孵育液，直至孵育液颜色变色后终止反应。甘油封片后，置于倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.7 透射电镜观察 取长满至80%的第5代细胞，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，制成单细胞悬液，1 000 r·min-1离心10 min。加入PBS，混匀重悬细胞，1 000 r·min-1离心10 min，重复1次。最后离心成细胞团块，加入2.5%戊二醛固定后，送至中国农业大学电镜室进行超微结构观察。

2 结 果

2.1 乌骨鸡体内黑色素细胞的培养与形态观察

由于采用腹膜分离黑色素细胞，所以培养上清中含有较多脂肪，12 h后弃掉上清和未贴壁的细胞。12 h时黑色素细胞已出现明显突起，24 h时细胞基本完全贴壁(图1A)，细胞传代过程中采用控制不同的消化时间去除杂细胞的方法，瓶内只留贴壁黑色素细胞(图1B)；继续培养至9 d，黑色素细胞形成明显多个突起，胞质内未见明显黑色素(图1C)；培养至10 d，细胞数量和突起进一步增多(图1D)，部分黑色素细胞胞质内可见明显的黑色素沉积(图1E)，并形成交联(图1F)。

2.2 黑色素细胞生长曲线测定

经检测，体外培养的黑色素细胞前期生长缓慢，从第7天开始细胞生长迅速，出现指数增长，至10 d细胞增长缓慢，出现停滞期(图2)，此时，合成的黑色素明显增多。

2.3 黑色素合成相关基因检测

黑色素细胞经纯化培养后，传至第10代，进行MITF、TYR、TRP-1和KIT基因表达检测。RT-PCR结果显示4种基因均有特异性扩增条带(图3)，细胞正常生长。扩增产物测序结果通过比对，为目的基因的核苷酸序列，表明扩增基因确实在细胞中有表达。

2.4 免疫细胞化学染色

取第5代处于对数生长期的黑色素细胞进行观察，此时，并不是所有黑色素细胞均可见明显黑色素沉积。因此，通过MITF免疫细胞染色鉴定黑色素细胞。图4A中可见，MITF染色后阳性信号位于黑色素细胞的胞核部分。而图4B可见，阴性对照染色时(不加一抗)，肉眼观察仅有不足半数的黑色素细胞胞浆内呈现明显的黑色素颗粒。由此说明，黑色素细胞经体外培养，已大量增殖。但由于不同生长阶段的黑色素细胞内黑色素合成状态亦有不同，不能单纯依据黑色素颗粒来判定细胞特性。

2.5 多巴染色

由于黑色素细胞含有大量酪氨酸酶，能够氧化多巴形成黑色物质，因此通过多巴染色可以鉴定黑色素细胞特性。本试验结果发现，经传代的培养细胞用多巴染色后，均呈现阳性反应。黑色素细胞突起明显，可以明显观察到胞浆内含有大量均质染色的黑色物质(图5)。

A.培养24 h；B.消化传代后；C.传代培养9 d；D.传代培养10 d；E.明显黑色素沉积；F.黑色素细胞形成交联。箭头指示黑色素细胞。标尺：50 μmA.Culture after 24 h；B.Digestion and passage；C.Passage on day 9；D.Passage on day 10；E.Obvious accumulation of melanin；F.Close contact of melanocytes.The arrows indicate the melanocytes.Bar：50 μm图1 体外培养乌骨鸡黑色素细胞形态Fig.1 The morphology of cultured melanocytes from Silky Fowl

图2 乌骨鸡黑色素细胞生长曲线Fig.2 The growth curve of cultured melanocytes from Silky Fowl

2.6 透射电镜观察

收集黑色素细胞进行透射电镜观察，见图6。结果显示，黑色素细胞的胞浆内可见各种不同阶段的黑色素小体形成过程。说明，分离培养的细胞产生的黑色物质是黑色素，成功实现黑色素细胞分离培养。

1.TRP-1基因；2.TRP-1阴性对照；3.KIT基因；4. KIT基因阴性对照；5.MITF基因；6.MITF基因阴性对照；7.TYR基因；8.TYR基因阴性对照；M.DM2000 plus marker1.TRP-1 gene；2.TRP-1 negative；3.KIT gene；4.KIT negative；5.MITF gene；6.MITF Negative；7.TYR gene；8.TYR negative；M.DM2000 plus marker图3 MITF、TYR、TRP-1和KIT基因RT-PCR检测Fig.3 Detection of MITF，TYR，TRP-1 and KIT genes by RT-PCR

3 讨 论

3.1 乌骨鸡黑色素细胞体外分离培养条件优化

人类及其它动物黑色素细胞分离培养由来已久，但是皮肤组织是目前分离培养的主要选择。研究发现，通过0.25% 胰酶消化人包皮组织，可以成功分离到黑色素细胞，但需要14 d细胞才能全部长满[14-15]。对于新生猪皮肤，通过0.25% 胰酶消化，3周后黑色素细胞长满融合[16]。白瑞等[17]通过分离培养羊驼皮肤黑色素细胞，发现利用0.2% Dispase和0.25%胰酶-0.02% EDTA两步消化法是分离有毛皮肤黑色素细胞的最佳方法，既可以减少对细胞的损伤，又可以提高细胞的分离纯度，缩短试验操作时间。乌骨鸡黑色素细胞的分离培养少见报道，仅见于皮肤组织分离培养[18]。由于乌骨鸡黑色素细胞位于皮肤的真皮层，细胞成分相对复杂，加大了分离培养的难度[19]。而乌骨鸡黑色素细胞多位于结缔组织，腹膜内黑色素细胞较为丰富[20]。并且相对于皮肤而言，腹膜内细胞成分较为简单。本研究选取鸡胚胎期腹膜组织分离黑色素细胞，原因主要是乌骨鸡鸡胚在蛋壳内，未接触外界环境，细菌污染少。结果表明，乌骨鸡胚胎期的腹膜组织特别适合于原代黑色素细胞的分离培养，培养条件经优化后培养9 d即可获得大量黑色素细胞，并保持其生物学特性。

A.MITF免疫细胞化学染色；箭头指示阳性细胞；B.阴性对照。空心箭头.胞浆内可见明显黑色素，实心箭头.胞浆内未见黑色素。标尺：50 μmA.Immunocytochemical stain of MITF.The arrows indicate positive cells；B.Negative control.Feint arrow indicates obvious melanin is observed in the cytoplasm，solid arrow indicates no melanin is observed in the cytoplasm.Bar：50 μm图4 黑色素细胞MITF免疫细胞化学染色Fig.4 Immunocytochemical stain of MITF in melanocytes

箭头指示黑色素细胞内多巴反应阳性信号。标尺：50 μmThe arrows indicate the DOPA positive signals in melanocytes.Bar：50 μm图5 多巴染色显示黑色素细胞Fig.5 Observation of melanocytes using DOPA stain

箭头指示黑色素细胞内不同阶段的黑色素小体The arrows indicate the different stages of melanosomes in melanocytes图6 黑色素细胞透射电镜观察Fig.6 Observation of melanocytes by transmission electron microscope

先期分离试验发现，单纯的0.25% 胰酶-0.02% EDTA消化需要较长时间，增加了细胞损伤程度，而且分离到的黑色素细胞数量较少。后选用0.2% Dispase和0.25% 胰酶-0.02% EDTA联合消化法，同时将两种消化酶加入到剪碎组织中，缩短了消化时间，减少长时间消化对细胞的损伤，分离到的黑色素细胞数量多，培养效果好。

纯化细胞时，多根据黑色素细胞和其它细胞的贴壁时间和消化时间的不同，通过控制时间差来纯化细胞。本试验发现，黑色素细胞和成纤维细胞的贴壁时间相似，所以很难通过控制贴壁时间来消除成纤维细胞。但是由于黑色素细胞贴壁牢固，可以通过控制消化时间来分离黑色素细胞与杂细胞。杂细胞首先会被消化下来，通过弃上清后可以清除成纤维细胞等杂细胞。本研究在消化杂细胞后，直接将完全培养基加入到培养瓶中，不再进一步消化黑色素细胞，可以减少胰酶对细胞的消化损伤，黑色素细胞可以快速长满融合。

3.2 黑色素细胞培养基的选择

原代黑色素细胞培养所需培养基极其严格。刘源等[21]培养人黑色素细胞时，研究发现加入佛波酯(TPA)和胎牛血清的角质细胞培养基(K-SFM)内，黑色素细胞生长旺盛，优于加入TPA、霍乱毒素(CT)、磷酸二酯酶抑制剂(IBMX)和谷氨酰胺的DMEM和F12混合培养基。TPA可以活化蛋白激酶C，通过ADG/PKC信号途径刺激黑色素细胞增殖。而TPA作为一种致癌剂，存在很大安全风险，同时也会限制某些色素性疾病的研究。霍乱毒素是神经毒素，可活化腺苷酸环化酶，通过cAMP/PKA途径刺激黑色素细胞增殖。白瑞等[17]通过采用DMEM/F12基础培养基，加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、CT、氢化可的松、胰岛素和庆大霉素后，羊驼皮肤黑色素细胞生长良好。bFGF是天然有丝分裂原，可活化酪氨酸激酶，经受体介导活化MAKP通路，促进细胞有丝分裂。胰岛素通过受体酪氨酸激酶途径，可以促进氨基酸进入细胞，促进蛋白质的合成代谢。本研究先前采用DMAM和F12混合培养基，加入HEPES、bFGF、氢化可的松、胰岛素、TPA和胎牛血清，可以维持黑色素细胞生长，但是生长周期较慢。后选用原代黑色素细胞专用培养基，营养成分与之前相比，多加入牛垂体提取物、牛转铁蛋白和肝素，此时细胞增殖周期有所缩短，生长状态较好。所以正确选择培养基也是黑色素细胞培养成功的关键。

3.3 黑色素合成相关基因正常表达

乌骨鸡体内的黑色素主要为真黑色素，其合成是一个复杂的生化反应过程。体内的酪氨酸在酪氨酸酶(TYR)的作用下氧化成多巴，TYR进一步将多巴氧化为多巴醌，多巴醌环化生成多巴色素，后经多巴色素异构酶(TRP)的作用生成5，6-二羟基吲哚羧酸，最后在氧化酶的作用下生成真黑色素[22]。所以TYR和TRP是黑色素合成过程中的关键酶，其基因表达水平可以反映黑色素细胞的生理状态。

乌骨鸡体内的黑色素细胞来自于神经嵴细胞，神经嵴细胞经腹侧和背侧迁移过程发育为成黑色素细胞。成黑色素细胞进一步在皮肤和内脏组织形成黑色素细胞，并产生黑色素。KIT基因被认为表达于成黑色素细胞，作为一种受体，通过与周围环境表达的干细胞因子(SCF)配体作用，调控细胞的存活[23]。而MITF基因是促进成黑色素细胞特化的首要转录因子，目前被认为是最主要的调控基因[24]。研究表明，在乌骨鸡胚胎发育早期，这几种基因表达上调，对于黑色素细胞迁移和存活具有重要意义[25]。

本研究培养的黑色素细胞内，既检测到黑色素合成基因的表达，也检测到与成黑色素细胞分化相关基因的表达，说明培养的黑色素细胞完全具有增殖和合成黑色素的活性，适合进行体外黑色素细胞的相关功能研究。

3.4 乌骨鸡黑色素细胞生物学特性分析

本试验在黑色素细胞培养过程中，通过控制消化时间，成功分离到胞浆内含有黑色素的细胞。继而通过传代培养，进一步纯化黑色素细胞。观察发现，体外培养的黑色素细胞与组织内观察到的细胞形态基本一致，都是具有长突起的树突样细胞。

体内试验认为，MITF基因作为关键基因，与多个基因存在直接关联，其中Sox10和Pax3可调控MITF的表达，而TRP1、TRP2、TYR、EDNRB、EDN3基因也受MITF调控，所以其表达水平可以反应细胞的活性状态[26]。由于MITF可通过调控酪氨酸基因家族启动子，进而影响酪氨酸基因的表达，影响黑色素的合成，所以在体外细胞培养时检测其表达水平，可以在一定程度上鉴定细胞特性。本研究通过免疫细胞化学染色，发现培养的黑色素细胞胞核内MITF蛋白的高表达。与此时黑色素细胞增殖旺盛，黑色素合成较多有关。本研究结果与之前报道猪皮肤黑素细胞和羊驼皮肤黑色素细胞的MITF表达位置相一致[16-17]。所以，通过检测MITF蛋白的表达，可以在一定程度上鉴定黑色素细胞，并且指示黑色素细胞的活性状态。

电镜结果进一步证实，分离培养的细胞是黑色素细胞，胞浆内可观察到不同阶段黑色素小体的形成过程。而且，利用黑色素细胞含有的酪氨酸酶能够氧化多巴形成黑色反应物质的特性，进行了多巴染色，发现胞浆内呈现明显黑色物质，培养的黑色素细胞具有明显的突起，符合乌骨鸡黑色素细胞的特征。由于黑色素颗粒不需多巴染色即可呈现，未经多巴染色时，可观察到部分细胞胞浆内有明显的黑色素沉积，而大部分细胞的胞浆内未见明显黑色素颗粒。经多巴染色后，所有细胞均呈现阳性反应。说明体外培养的黑色素细胞处于不同的黑色素合成状态，或无外界刺激时，并不一定合成黑色素，进一步成熟或出现外界刺激时，可增加黑色素的合成。

4 结 论

本研究通过选取胚胎腹膜和专用培养基，利用消化时间差异成功建立了乌骨鸡黑色素细胞体外分离培养体系。并经细胞形态和黑色素小体观察，多巴反应、MITF蛋白和黑色素合成相关基因的表达等检测，进一步确定了细胞的生物学特性，为今后研究黑色素细胞功能奠定基础。

[1] 徐桂芳，陈宽维.中国家禽地方品种资源图谱[M].北京：中国农业出版社，2003. XU G F，CHEN K W.Chinese poultry local variety resources[M].Beijing：China Agriculture Press，2003.(in Chinese)

[2] 王晓通.浅析乌鸡的药用及保健价值[J].上海畜牧兽医通讯，2004，3：52-53. WANG X T.Analysis of medical and healthy value of Silky Fowl [J].ShanghaiJournalofAnimalHusbandaryandVeterianryMedcine，2004，(3)：52-53.(in Chinese)

[3] 谢明勇，田颖刚，涂勇刚.乌骨鸡活性成分及其功能研究进展[J].现代食品科技，2009，25(5)：461-465. XIE M Y，TIAN Y G，TU Y G.Review of the bioactive components of black-bone Silky Fowl and their function [J].ModernFoodScienceandTechnology，2009，25(5)：461-465.(in Chinese)

[4] 耿拓宇，张学余，陈宽维，等.泰和乌骨鸡出雏后黑色素的分布和沉积[J].中国家禽，2000，22(7)：10-12. GENG T Y，ZHANG X Y，CHEN K W，et al.Pigmentation of melanin in Taihe Silky Fowl after birth [J].ChinaPoultry，2000，22(7)：10-12.(in Chinese)

[5] ORTOLANI-MACHADO C，DE FREITAS P E，FARACO C.Special features of dermal melanocytes in white silky chicken embryos [J].AnatRec，2008，291：55-64.

[6] 王哲鹏，邓学梅，吴常信.乌鸡黑色素在果蝇体内排铅解毒的研究[J].中国畜牧杂志，2007，43(7)：50-52. WANG Z P，DENG X M，WU C X.Effect of melanin derived from white Silky Fowl on accumulation and toxicity of lead in drosophila melanogaster [J].ChineseJournalofAnimalScience，2007，43(7)：50-52.(in Chinese)

[7] BIDLA G，DUSHAY M S，THEOPOLD U.Crystal cell rupture after injury in Drosophila requires the JNK pathway，small GTPases and the TNF homolog Eiger [J].JCellSci，2001，120：1209-1215.

[8] MACKINTOSH J A.The antimicrobial properties of melanocytes，melanosomes and melanin and the evolution of black skin [J].JTheorBiol，2001，211：101-113.

[9] CHISHOLM S T，COAKER G，DAY B，et al.Host-microbe interactions：shaping the evolution of the plant immune response [J].Cell，2006，124：803-814.

[10] SCOTT G，LEOPARDI S，PRITUP S，et al.Proteinase-activated receptor-2 stimulates prostaglandin production in keratinocytes：analysis of prostaglandin receptors on human melanocytes and effects of PGE2 and PGF2alpha on melanocyte dendricity [J].JInvestDermatol，2004，122：1214-1224.

[11] SUGATA K，KITAHARA T，TAKEMA Y.Changes of human skin in subepidermal wound healing process [J].SkinResTechnol，2008，14：436-439.

[12] LEVESQUE M，FENG Y，JONES R A，et al.Inflammation drives wound hyperpigmentation in zebrafish by recruiting pigment cells to sites of tissue damage [J].DisModelMech，2003，6：508-515.

[13] ZHANG W，DAI M，FRIDBERGER A，et al.Perivascular-resident macrophage-like melanocytes in the inner ear are essential for the integrity of the intrastrial fluid-blood barrier [J].ProcNatlAcadSciUSA，2012，109(26)：10388-10393.

[14] 陈菊萍，冉玉平，魏大鹏，等.人黑素细胞培养最佳条件的选择和生物学鉴定[J].中国麻风皮肤病杂志，2007，23(3)：3-8. CHEN J P，RAN Y P，WEI D P，et al.Optimum condition selection and biological identification of human melanocytes[J].ChinaJournalofLeprosyandSkinDiseases，2007，23(3)：3-8.(in Chinese)

[15] LI L，FUKUNAGA-KALABIS M，HERLYN M.Isolation and cultivation of dermal stem cells that differentiate into functional epidermal melanocyes [J].MethodsMolBiol，2012，806：15-29.

[16] JULE S，BOSSE P，EGIDY G，et al.Establishment and characterization of a normal melanocyte cell line derived from pig skin[J].PigmentCellRes，2003，16 (4)：407-410.

[17] 白 瑞，于志慧，范瑞文，等.羊驼皮肤黑色素细胞体外培养鉴定[J].畜牧兽医学报，2013，44(4)：549-556. BAI R，YU Z H，FAN R W，et al.Culture，identification of alpaca skin melanocytesinvitro[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(4)：549-556.(in Chinese)

[18] 田颖刚，廖春艳，徐德利.乌骨鸡皮肤黑色素细胞的原代培养及鉴定[J].中国家禽，2014，36(12)：6-10. TIAN Y G，LIAO C Y，XU D L.Primary culture and identification of skin melanocytes from black-bone Silky Fowl (Gallusgallusdomesticus Brisson) [J].ChinaPoultry，2014，36(12)：6-10.(in Chinese)

[19] AGNIESZKA W G，ANNA P，DAGMARA P，et al.Pheomelanin in the skin ofHymenochirusboettgerl(Amphibia：Anura：Pipidae) [J].ExpDermatol，2012，21：535-561.

[20] MUROYA S，TANABE R I，NAKAJIMA I，et al.Molecular characteristics and site specific distribution of the pigment of the silky fowl [J].JVetMedSci，2000，62(4)：391-395.

[21] 刘 源，金 岩，王新文，等.高纯度黑色素细胞培养方法的改进[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2003，13(1)：21-26. LIU Y，JIN Y，WANG X W，et al.Improvements in culturing skin melanocytes[J].ChineseJournalofConservativeDentistry，2003，13(1)：21-26.(in Chinese)

[22] ITO S，WAKAMASTU K，OZEKI H.Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis[J].PigmentCellRes，2000，13(8)：411-421.

[23] WEHRLE-HALLER B.The role of Kit-ligand in melanocyte development and epidermal homeostasis [J].PigmentCellRes，2003，16：287-296.

[24] GODING C R.Melanocyte development and malignant melanoma[J].Forum(Genova)，2000，10：176-187.

[25] LI Y L，ZHU X P，YANG L，et al.Expression and network analysis of genes related to melanocytes development in the Silky Fowl and White Leghorn embryos[J].MolBiolRep，2011，38(2)：1433-1441.

[26] 李玉林.黑色素细胞发育相关基因在乌骨鸡和白莱航鸡胚胎中的表达差异研究 [D].北京：中国农业大学，2010. LI Y L.Research on differential expressed genes related to melanocyte development in Silky Fowl and White Leghorn embryos[D].Beijing：China Agricultural University，2010.(in Chinese)

(编辑 程金华)

Culture and Identification of Primary Melanocytes from Silky Fowlinvitro

HAN De-ping，WANG Shu-xiang，ZHANG Yuan-yuan，YANG Zu，LI Jun-ying，DENG Xue-mei*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

The purpose of this study was to establish a method for melanocytes culture and identification systeminvitro，and to provide an ideal biological material for investigating the melanocytes functions.Peritoneum of Silky Fowl was collected and digested by dispaseⅡ and trypsin-EDTA mixed digestive solution under different digestive time.The pure melanocytes were obtained after continuous passages.Through the observation of cell morphology and cell growth curve showed that the primary melanocytes grew well under the specific medium.The cell specificities were further confirmed by the morphology，ultrastructure observation under electron transmission microscope，genes expression associated with melanin synthesis，and cell characteristic by DOPA stain and immunocytochemistry.The successfully cultured melanocytes sustained the normal biological characteristics on passage 10 demonstrating that the culture of primary melanocytes was accomplished under thisinvitrosystem.All together，theinvitroculture system of melanocytes from Silky Fowl was successfully established in our study.

Silky Fowl；melanocyte；primary culture；identification

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.010

2014-10-30

国家自然科学基金(31472082)；国家863计划(2013AA102501)；中央高校基本科研业务费专项资金(2014BH003)

韩德平(1984-)，男，山东潍坊人，博士，主要从事组织胚胎学的研究，E-mail：handeping1984@163.com

*通信作者：邓学梅，E-mail：deng@cau.edu.cn

S813.3

A

0366-6964(2015)06-0949-08