单核细胞增生李斯特菌非编码RNA rli87基因缺失株的构建、鉴定及其生长特性初步研究

谢 堃，乔 军*，孟庆玲，彭叶龙，赵海龙，马 玉，陈 诚，才学鹏，陈创夫

(1.石河子大学动物科技学院，动物疾病防控兵团重点实验室，石河子 832003；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046 )

单核细胞增生李斯特菌非编码RNArli87基因缺失株的构建、鉴定及其生长特性初步研究

谢 堃1，乔 军1*，孟庆玲1，彭叶龙1，赵海龙1，马 玉1，陈 诚1，才学鹏2，陈创夫1

(1.石河子大学动物科技学院，动物疾病防控兵团重点实验室，石河子 832003；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046 )

拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株，对其进行分子鉴定，分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5rli87基因缺失突变体，并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体，将其转化入LM-SB5感受态细胞，利用温度(42 ℃)和氯霉素(10 μg·mL-1)的抗性双重压力来实现同源重组，筛选同源重组菌进行分子鉴定，测定缺失株与母源野毒株37 ℃条件下生长曲线。结果显示：PCR和测序结果证实成功获得了LM-Δrli87重组菌。通过25代的连续传代，PCR鉴定结果显示，该缺失株具有良好的遗传稳定性。与野毒株进行对比，在37 ℃条件下缺失株与野毒株的生长差异不显著(P>0.05)。非编码RNArli87基因在37 ℃条件下对LM生长没有明显的调控作用。

rli87基因；LM感受态细胞；缺失株；生长特性；同源重组

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一种兼性胞内寄生的革兰阳性致病菌，生存能力强，存在范围广[1]。LM主要通过消化道引起动物和人的急性感染，对畜牧业和人类健康造成了巨大的威胁，因此，LM被WHO列为四大食源性致病菌之一[2-3]。

在LM感染宿主的过程中需要众多的毒力因子参与。参与LM侵染和胞内寄生生活相关的毒力基因主要集中在LM致病岛1(LIPI-1)和致病岛2(LIPI-2) 2个区域中。LIPI-1含有6个基因，依次为prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB；LIP-2又称为内化素小岛，主要编码一些小分子的内化素[4-5]。近年来大量研究发现，LM非编码ncRNA在调控其生长、基因表达、糖代谢、金属离子转运、生物膜形成、胞内寄生及环境应激过程中也扮演着重要的角色，其调控模式已经成为LM调控网络中的最重要作用方式之一[6]。根据ncRNAs的调控机制，LM ncRNAs可以分为3种：顺式作用RNA(cis-acting RNAs，如核糖开关)、反义RNA(anti-sense RNAs，asRNAs)和反式编码的小RNA(trans-encoded small RNAs，sRNAs)。顺式作用RNA位于mRNA的5'端非编码区(5'-UTR)或 3'端非编码区(3'-UTR)，既可以影响细菌的翻译，也可影响转录，还可以影响到mRNA的稳定性和折叠结构[7-8]。研究发现，sRNA通过与目的mRNA上短的、不连续的、互补的区域碱基互补配对来发挥作用，并且一种sRNA可以与多种mRNA相互作用。sRNA能够抑制也能够激活目的mRNA的翻译，同时sRNA与目的mRNA频繁的结合会导致mRNA被RNases快速的降解[9]。本研究用RNAStructure5.0生物信息学软件对rli87二级结构进行预测分析，结果发现在其二级结构中存在三个茎环结构，通过进一步对比分析发现环上的序列与LM毒力岛Ⅰ、毒力岛Ⅱ上的独立基因及环境应激相关基因具有多个位点的非连续互补配对序列，因此推测rli87可能通过调节环境应激基因的表达在LM毒力及环境应激过程中发挥着调控作用。rli87基因属于sRNA，然而目前有关rli87基因的生物学功能尚不清楚。本研究应用同源重组技术构建rli87基因缺失株LM-Δrli87，研究rli87缺失对LM生长的影响，以期为进一步揭示rli87在LM致病性和环境应激能力的调控作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体及试剂

LM-SB5野毒株由石河子大学动物科技学院分离，分离自发病绵羊脑组织，经分子生物学鉴定后由石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室保存。TaqplusDNA聚合酶、Pfu DNA Polymerase、dNTPs、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自上海生物工程公司。T4 DNA连接酶、DNA Marker、pMD19-T载体购自大连TaKaRa公司。细菌基因组提取试剂盒购自诺维森公司。限制性核酸内切酶(KpnⅠ、PstⅠ)购自Promega公司，pKSV7穿梭质粒由扬州大学朱国强博士馈赠。

1.2 引物设计

根据GenBank登录的LM-EGD基因组序列(登录号：AL591824)，用DNAMAN软件进行同源性分析，选择保守区域，用Primer 5.0软件设计扩增上游同源臂引物P1-P2，下游同源臂引物P3-P4。融合PCR的引物为P1-P4，全长1 095 bp。在P1-P4 引物的5′端加酶切位点和保护性碱基。设计检测引物P5-P6，全长584 bp(表1)。引物由上海生物工程公司合成。

1.3Δrli87基因缺失融合片段的构建

提取LM-SB5株基因组，先用引物P1-P2 和P3-P4分别扩增上、下游同源臂，然后以P1-P4为引物，用SOE-PCR技术融合上、下游同源臂。先用Pfu DNA Polymerase对上、下游同源臂互补延伸10个循环，再加入P1-P4引物各0.4 μL扩增融合片段的全长。采用20 μL反应体系(上、下游同源臂各2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 dNTPs 2 μL，水11.2 μL，Pfu DNA Polymerase 0.3 μL)。反应条件：96 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，得到Δrli87基因缺失的融合片段。回收融合片段，与pMD19-T载体连接，用PCR和酶切方法筛选pMD19-T-Δrli87重组质粒。

1.4 pKSV7-Δrli87穿梭质粒的构建

将pMD19-T-Δrli87和pKSV7质粒分别用KpnⅠ、PstⅠ双酶切，酶切后分别回收条带。将酶切回收的融合片段与pKSV7质粒于4 ℃冰箱连接过夜，获得阳性转化子，用PCR和酶切方法验证pKSV7-Δrli87质粒。

表1 本研究中用到的PCR引物

Table 1 PCR primers used in this study

引物Primers序列(5'-3')Sequence产物/bpAmplifiedlengthsP1P2GGGGTACCAACTTAGACAAGATGACGCAGCCAACATTTATTAACAAAATCTGTTATAGTTCTTCTGCAACCC518P3P4GGGTTGCAGAAGAACTATAACAGATTTTGTTAATAAATGTTGGAACTGCAGACTCTATCTCGCAATGTAAGC577P5P6AGAACTAGTGGTTTTCCCCAAATAAATACGCACATC584

1.5 LM-Δrli87缺失株的构建、筛选与鉴定

按文献[6]制备LM感受态细胞。取100 μL感受态细胞加入8 μL pKSV7-Δrli87质粒，进行电转化，电转条件：2.5 kV·cm-1、0.5 ms。电转化后，冰浴10 min，向电击杯中加入800 μL BHI液体培养基，37 ℃振荡培养(200 r·min-1)3 h。将电转后的菌液涂在含有氯霉素(10 μg·mL-1)的BHI固体培养基上，通过PCR鉴定获得的阳性菌；在氯霉素抗性(10 μg·mL-1)的BHI液体培养基、42 ℃条件下传代，以P5-P6为引物进行PCR扩增，并将扩增产物送至华大基因公司进行测序。

1.6 LM-Δrli87缺失株遗传稳定性的检测

将构建的LM-Δrli87接种在BHI液体培养基中，于37 ℃恒温摇床连续培养传25代，提取缺失株的基因组DNA，用引物P5-P6做PCR扩增，检测LM-Δrli87缺失株遗传稳定性。

1.7 LM-Δrli87缺失株生长特性初步研究

将野毒株SB5和缺失株LM-Δrli87在平板上划线培养，然后挑取单菌落分别接种在10 mL BHI液体培养基中，在37 ℃ 180 r·min-1条件下培养12 h，OD600 nm≈0.6时，将野毒株和缺失株菌液以1∶100的比例接入BHI液体培养基，于37 ℃ 180 r·min-1条件下培养，每2 h从培养液中吸取菌液200 μL，测定不同时间点OD600 nm值，绘制生长曲线，进行比较分析。

2 结 果

2.1 目的基因的扩增

以LM SB5基因组为模板，P1-P2引物扩增得到了大小与预期518 bp相符的上游同源臂；P3-P4 引物扩增得到了大小与预期577 bp相符的下游同源臂(图1)。用P1-P4引物对上、下游同源臂进行融合扩增，结果扩增的融合片段与预期的1 095 bp相符(图2)。pMD19-T-Δrli87重组质粒PCR和酶切鉴定均正确，目的条带为1 095 bp(图3)。

M.DL2000 DNA相对分子质量标准;1.上、下游同源臂产物；2.阴性对照；3.下游同源臂产物;4.上游同源臂产物M.DL2000 DNA marker;1.The product of upstream and downstream homologous arms;2.Negative control;3.The downstream homologous arm products;4.The upstream homologous arm products图1 同源臂基因的PCR扩增Fig.1 Homology arm gene amplified by PCR

M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1、2、4、5、7、8.扩增产物M.DL2000 DNA marker；1,2,4,5,7,8.The amplification products图2 重叠延伸PCR的扩增产物Fig.2 Amplification products by overlap extension

M.DL5000 DNA相对分子质量标准；1～4.酶切产物M.DL5000 DNA marker；1-4.The products from pMD19-T-Δrli87图3 pMD19-T-Δrli87的酶切鉴定Fig.3 Identification of pMD19-T-Δrli87 by enzyme digestion

2.2 pKSV7-Δrli87质粒的鉴定

pKSV7-Δrli87质粒转化入E.coliDH5α感受态细胞，获得阳性菌，做菌液PCR检测，提取阳性菌的质粒，PstⅠ、KpnⅠ对质粒同步双酶切。酶切产物电泳检测结果与预期片段1 095 bp相符(图4)。

M.DL5000 DNA相对分子质量标准；3～7.双酶切产物M.DL5000 DNA marker；3-7.The products from pKSV7-Δrli87图4 pKSV7-Δrli87的酶切鉴定Fig.4 Identification of pKSV7-Δrli87 by enzyme digestion

2.3 LM-Δrli87缺失株的PCR鉴定

用引物P5和P6对疑为重组缺失菌株进行PCR扩增鉴定。未重组的LM扩增的产物为783 bp，而重组的为584 bp，电泳结果显示与预期结果相符(图5)。584 bp片段测序后发现，已经缺失了rli87基因，表明已经成功构建了重组LM-Δrli87菌株。

2.4 LM-Δrli87缺失株遗传稳定性鉴定

连续传代25代后的缺失株PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，缺失菌株产物为584 bp的条带，与预期结果相符，说明缺失株在BHI中稳定传代，缺失株具有很好的遗传稳定性。(图6)。

M.DNA相对分子质量标准;1～5.重组菌的PCR产物;6.SB5阴性对照.M.DL2000 DNA marker;1-5.PCR products;6.Negative control图5 LM-Δrli87重组菌的PCR鉴定Fig.5 PCR identification of recombinant LM-Δrli87

M.DNA相对分子质量标准;1～10.重组菌PCR产物M.DL2000 DNA marker;1-10.The PCR products图6 LM-Δrli87重组菌遗传稳定性PCR鉴定Fig.6 Identification of genetic stability of recombinant LM-Δrli87 by PCR

2.5 LM-Δrli87缺失株生长特性

图7是野毒株和缺失株在37 ℃温度条件下的生长情况。在37 ℃条件下，野毒株和缺失株培养差异不显著(P>0.05)，表明rli87基因在37 ℃条件下对LM的生长速度没有明显的调控作用。

图7 LM-Δrli87和LM-EGD菌株在37 ℃条件下的生长曲线Fig.7 Growth curves of LM-Δrli87 and LM-EGD at 37 ℃

3 讨 论

迄今为止，在李斯特菌中已被证实的sRNA有113个，其中有88个同时存在于致病性李斯特菌与非致病性李斯特菌，25个只存在于LM中。S.Sievers等对依赖于伴侣分子蛋白Hfq的ncRNA LhrC 进行了研究，构建了LhrC基因缺失株，通过与母源株比较，证实LM ncRNA LhrC在0.07%胆酸盐环境应激中扮演了重要角色[10]。虽然对于sRNAs功能的研究数据有限，最近一些sRNAs，包括rliB、rli31、rli33-1和rli50被证明在细菌毒力和细菌生长的过程中发挥了调控作用[11]。越来越多的研究还发现，ncRNA 在LM生长、蔗糖代谢、群体感应和毒力等方面可能发挥了重要的调控作用[12]，其调控模式已经成为LM调控网络中最重要的作用方式之一。

同源重组(homologous recombination)是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导入基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的[13-14]。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列(即特异性位点，又称附着点，attachment site，att)和位点特异性的蛋白因子(即重组酶)参与催化[15]。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。研究证实，在同源重组的染色体整合中，同源片段越长，整合频率越高，通常情况下，大于300 bp的同源片段可有效实现同源重组[16]。因此，本研究扩增了rli87基因上游和下游共584 bp的基因序列作为同源片段，从而提高外源基因在LM染色体中的整合效率。同时在引物序列中引入2个酶切位点(KpnⅠ、PstⅠ)，作为同源重组载体的多克隆位点，可根据研究的需要插入目的基因在LM染色体上进行同源重组。

将质粒转入宿主菌胞内是构建缺失株的重要环节之一。目前，实验室中最常用的转化方法有热击法、原生质体转化法和电穿孔法。对于LM这样的革兰阳性菌，由于细菌细胞壁较厚，热击法很难对其起作用，因此转化常用电穿孔法，且电穿孔法便于使用[17-18]。然而，质粒的浓度、电压、感受态细胞的特性、缓冲液的浓度等都是影响电转化效率的重要因素。感受态细胞的细菌浓度在一定规范内，细菌浓度越高，转化效率就越高，两者呈正相关。电场强度是影响电转化效率的主要因素，时间太短或太长均会使转化效率降低[6，19]。在本研究的电转试验中，对于电转的条件进行了大量的摸索，获得具有良好遗传稳定性的LM-Δrli87。

本研究运用RNAStructure 5.0生物信息学软件对rli87二级结构进行预测分析，结果发现在其二级结构中存在三个茎环结构，通过进一步对比分析发现环上的序列与LM毒力岛Ⅰ、毒力岛Ⅱ上的毒力基因及环境适应因子具有多个位点的非连续互补配对序列，因此推测rli87可能通过调控环境适应因子相关基因的表达在LM不同环境应激过程有着调控影响。通过对比缺失株和野毒株的生长曲线，结果发现在37 ℃条件下，两株菌的生长情况没有显著差异，提示rli87基因在37 ℃条件下对LM的生长情况没有明显的调控作用。有关rli87在LM环境适应及毒力调控中的作用，尚需进一步研究。

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(编辑 白永平)

Construction，Identification of ncRNArli87 Gene Deletion StrainsListeriamonocytogenesand Its Growth Characteristics

XIE Kun1，QIAO Jun1*，MENG Qing-ling1，PENG Ye-long1，ZHAO Hai-long1，MA Yu1，CHEN Cheng1，CAI Xue-peng2，CHEN Chuang-fu1

(1.KeyLaboratoryofPreventionandControlofAnimalDisease，CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832003，China；2.KeyLaboratoryofNationalVeterinaryEtiologicalBiology，LanzhouVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730046，China)

In this study，non-coding RNArli87 gene deletion strain of LM was constructed and identified，and growth characteristics of deletion strain was studied.Therli87 gene deletion mutant was constructed by fusion PCR method，and then pKSV7-Δrli87 shuttle vector was constructed，which was transformed into competent cells LM-SB5.Homologous recombination was conducted using temperature (42 ℃) and chloramphenicol (10 μg·mL-1) resistance to achieve therli87 gene deletion strain，and growth curves of wild strain and deletion strain were assayed at 37 ℃.The PCR and sequencing results confirmed that LM-Δrli87 was successfully obtained.PCR identification results showed that the deletion strain has good genetic stability through 25 generations of continuous passage.Comparison with the wild strain，there was no significant difference (P>0.05) in growth between deletion mutant and wild strain at 37 ℃.The results suggest thatrli87 gene did not play significant role in regulatory growth under the conditions of 37 ℃.

rli87 gene；Listeriamonocytogenes；deletion strain；growth characteristics；homologous recombination

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.016

2014-09-01

国家国际科技合作专项(2014DFR31310)；国家自然科学基金(30960274；31360596)

谢 堃(1990-)，女，硕士生，主要从事病原分子生物学研究，E-mail：xiekuns@gmail.com

*通信作者：乔 军，Tel：+86-993-2055036；E-mail：qj710625@163.com

S852.61

A

0366-6964(2015)06-0998-06