新疆阿拉山口口岸地区鼠类棘球蚴感染情况调查

肖云霞，徐新龙，尹小平，王安东，闫遵祥，段成任，徐 军*

(1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.阿拉山口出入境检验检疫局，阿拉山口 833418；3.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

新疆阿拉山口口岸地区鼠类棘球蚴感染情况调查

肖云霞1，徐新龙2，尹小平2，王安东1，闫遵祥1，段成任3，徐 军2*

(1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.阿拉山口出入境检验检疫局，阿拉山口 833418；3.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

对新疆阿拉山口口岸地区鼠类棘球蚴感染情况进行系统调查。选择阿拉山口口岸三个不同区域(野外区、城郊综合区和城区)，2013—2014年连续2年采集鼠类样本；剖检、分离肝，对所有样本提取肝基因组DNA，利用聚合酶链式反应扩增棘球蚴线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1(Cox1)、NADH脱氢酶(ND1)等基因并测序。剖检发现8份样品具有包囊，感染率为2.08%；分子鉴定发现有10份样品呈PCR阳性，感染率为2.60%，Cox1基因Blast分析中有8份样品与青海检测的苏俄多房棘球绦虫的相似性最高(登录号：JQ 690286.1)，为85%；ND1基因Blast分析，另2份样品与多房棘球蚴相似性最高(登录号：AB 720065.1)，为100%；统计学分析发现野外区、城郊综合区鼠类感染率分别为2.74%和2.38%，而城区未检测到病原体。阿拉山口口岸野外区野鼠棘球蚴感染率最高，易感鼠种为大沙鼠。

棘球蚴病；野鼠；阿拉山口口岸

棘球蚴病(echinococcosis)又称包虫病，是一类由棘球属绦虫的幼虫棘球蚴寄生于人畜体内而引起的严重人畜共患疾病 ，呈世界性分布[1-2]。全球超过100万人患有此病，其中很多人会患有严重的致命性临床综合征[3]。它主要影响发展中国家和地区的贫困人群，同时对动物及动物性产品的国际贸易也产生一定的阻碍[4-5]。我国是世界棘球蚴病高发的国家之一，其中又以新疆、西藏、宁夏、甘肃等7省(区)最为严重[6]。目前，在我国分布有三种棘球绦虫，分别为多房棘球绦虫(E.multilocularis)、细粒棘球绦虫(E.granulosus)和石渠棘球绦虫(E.shiquicus)[7]。棘球绦虫的生活史复杂，需要经历不同的中间宿主和终末宿主才能完成其生活史，中间宿主除牛、羊等反刍动物和人以外，还包括多种啮齿类野生动物如田鼠、褐家鼠等[8]。野生动物之间以及与家养动物之间的联系促进了棘球蚴病的传播与流行。

阿拉山口口岸位于我国西部，是目前唯一集铁路、公路、管道原油运输为一体的国家一类陆路口岸，整个口岸毗邻哈萨克斯坦塔尔迪—库尔干州，是中亚荒漠和准噶尔荒漠间唯一的通道。阿拉山口口岸所处环境适宜多种荒漠啮齿动物生存，包括大沙鼠(Rhombomysopimus)、红尾沙鼠(Merioneserythrourus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)等多种鼠类[9-10]。随着经济贸易发展，频繁的交通增加了鼠类的活动范围及频率，同时也为棘球蚴的传播提供了便利。

为了预防棘球蚴通过鼠类的传播，作者对该区鼠类携带棘球蚴的基本概况开展了诊断调查。将传统的形态学诊断方法及PCR分子生物学诊断方法相结合，对阿拉山口口岸地区鼠类所携带的棘球蚴进行病理组织学观察，同时根据病原线粒体Cox1基因保守序列设计特异性引物进行扩增。然后参照OIE陆生动物手册对疑似阳性样品进行多房棘球蚴及细粒棘球蚴两种常见棘球蚴病种属鉴别；最终Blast比对分析总结，以期了解阿拉山口口岸地区鼠类携带棘球蚴基本状况，为新疆边境口岸地区采取相应疾病防控措施提供基础信息。

1 材料与方法

1.1 实验材料

自2013年至2014上半年采集于城区(13只)、城郊综合区(42只)及野外区(329只)三大区域，共384只鼠样。由阿拉山口出入境检验检疫局医学媒介生物实验室鉴定完毕后提供。剖检鼠样，肉眼观察有无包囊，肝是否存在病变。将部分肝包囊于10%福尔马林溶液(3.4%～4%甲醛)固定，余样放入冻存管中标记，液氮速冻后于-70 ℃保存。

1.2 主要试剂

总DNA提取试剂盒(DNeasy®Blood & Tissue kit)，购自德国QIAGEN公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、T-载克隆试剂盒(pMDTM19-T Vector cloning kit)均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒，购自北京TIANGEN生物工程有限公司；PCR引物合成、测序均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司完成。

1.3 病理组织学观察

将常规制备石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜观察病理组织形态。

1.4 样品DNA制备

分别对所有鼠样的肝及包囊剪取约25 mg检测样品，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，按照总DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，产物于-20 ℃保存备用。

1.5 PCR检测

1.5.1 棘球蚴的PCR检测 PCR以线粒体中细胞色素C氧化酶(Cox1)基因序列设计的特异性引物Cox1-F与Cox1-R序列为目的片段，以样品基因组DNA为扩增模板。PCR扩增反应体系50 μL：其中dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL、10×PCR Buffer 5 μL、Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL、引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O补至50 μL混匀。扩增参数：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

1.5.2 多房棘球蚴与细粒棘球蚴PCR检测方法 将以上检测到疑似阳性样品为模板进行两种常见棘球蚴种型鉴定，多房棘球蚴与细粒棘球蚴PCR引物参照OIE陆生动物手册(2008)中序列(表1)[11]。1.5.2.1 多房棘球蚴：引物选择Cest1与Cest2。扩增体系为50 μL：10×PCR Buffer 5 μL、 MgCl25 μL(2.5 mmol·L-1)、dNTP 4 μL(0.2 mmol·L-1)、引物各2 μL(10 μmol·L-1)、Taq酶1 U、DNA模板2 μL、ddH2O补至50 μL混匀。扩增参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min[12]。

1.5.2.2 细粒棘球蚴：引物选择Eg1121a与Eg1122a。扩增体系为50 μL：10×PCR Buffer 5 μL、MgCl23 μL(1.5 mmol·L-1)、dNTP 4 μL(0.2 mmol·L-1)、引物各2 μL(20 μmol·L-1)、Taq聚合酶2.5 U、DNA模板2 μL、ddH2O补至50 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min[13]。

1.5.3 电泳检测 取6 μL PCR扩增产物和2 μL Loading Buffer混合液及DNA标准Marker对照，于1.5%琼脂糖(含GenGreen核酸染料)凝胶中100 V电泳45 min，于凝胶成像仪中观察结果。

表1 引物序列

Table1 Primer sequences

目标物种Targetspecies基因Gene引物名称Primerdesignation序列Sequences扩增片段/bpAmpliconsize棘球蚴EchinococcusCox1Cox1-FCox1-R5'-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3'5'-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3'450多房棘球蚴E.multilocularisND1Cest1Cest25'-TGCTGATTTGTTAAAGTTAGTGATC-3'5'-CATAAATCAATGGAAACAACAACAAG-3'395细粒棘球蚴E.granulosusEgG1HaeⅢEg1121aEg1122a5'-GAATGCAAGCAGCAGATG-3'5'-GAGATGAGTGAGAAGGAGTG-3'133

1.6 PCR产物回收

将以上所得目标片段PCR产物进行凝胶电泳，在紫外灯下切割所需片段，利用胶回收试剂盒进行纯化回收。

1.7 目的基因的克隆与测序

取适量纯化回收产物与pMD19-T Vector进行连接，转化JM109大肠杆菌。挑取阳性克隆菌落接入少量LB培养基(Amp+，100 mg·mL-1)中，150 r·min-1，37 ℃振荡培养过夜。参照质粒提取试剂盒说明提取质粒，送北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序。

1.8 结果处理

序列分析：测序结果利用DNAStar、DNAman等软件进行序列拼接分析，运用Blast进行相似性比对。

数据处理：运用Excel统计软件分析感染率。

2 结 果

2.1 样本鼠的分类鉴定

本研究共捕获384只样本鼠，由阿拉山口出入境检验检疫局医学媒介生物实验室采用形态学法鉴定，其中大沙鼠(Rhombomysopimus)230只、红尾沙鼠(Merioneserythrourus)45只、褐家鼠(Rattusnorvegicus)54只、小家鼠(Musmusculus)19只、小仓鼠(Cricetulusbarabensis)16只、子午沙鼠(Merionesmeridianus)9只、西伯利亚五趾跳鼠(Allactagasibirica)9只、小五趾跳鼠(Allactaga.elater)1只以及怪柳沙鼠(Merionestamariscinus)1只。

2.2 剖检结果

剖检384只样本鼠，有8只携带包囊，包囊泡形状及大小不等，多呈乳白色、灰白色或微带些淡黄色的圆形或椭圆形串泡样结节。其中6只包囊游离于腹腔或附着于肠系膜上，其长直径为0.736 cm±0.012 cm、短直径为0.406 cm±0.005 cm；2只包囊附着或嵌于肝上，则剖检感染率为2.08%(8/384)，其直径为2.120 cm±0.146 cm(图1)。

2.3 组织切片观察

对肝、囊泡内部及囊泡壁等结构的病理组织切片进行显微镜观察并拍照(图2)，可观察到包囊壁由上皮样细胞和成纤维细胞构成，囊内含大量原头蚴，肝间质结缔组织增生，部分肝细胞呈水泡变性，有炎性渗出物浸润。

2.4Cox1片段PCR检测

以阿拉山口口岸地区鼠类肝或包囊DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，得到Cox1基因450 bp的扩增条带，有10份样品呈PCR阳性，与预期大小相符(图3)。PCR产物纯化后进行双向测序，经DNAman软件序列拼接及NCBI/Blast分析：(1)其中8份样品(6份为附着于肠系膜或游离于腹腔内的包囊、2份为未观察到包囊的肝)测得片段长度为432 bp，Blast分析与青海检测的苏俄多房棘球绦虫(Echinococcussp.，JQ 690286.1)相似性为(361/424)85%，与Taenialaticollis(AB 731727.1)相似性为(355/419)85%，与Taeniamadoquae(AB 731726.1)相似性为(356/422)84%；(2)其余2份样品(为附着或嵌于肝的包囊)测得片段大小为435 bp，Blast分析与多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis，AB 777915.1)的相似性可达(433/435)99%。

A、C.嵌于鼠肝内包囊；B.游离于鼠腹腔内包囊A，C.Cyst in the liver of rodents；B.Cyst free in the abdomen of rodents图1 鼠肝及腹腔中包囊Fig.1 Cyst in the liver and abdomen from rodents

A.肝组织及包囊壁结构；B.部分肝细胞水泡变性并有炎性渗出物浸润；C.充满原头节的包囊；D.包囊内原头节结构A.Histology structure of liver and hydatid cyst wall；B.Vacuolar degeneration of hepatic cells with inflammatory exudate infiltrates；C.Hydatid cyst with protoscoleces；D.Histology structure of protoscoleces in cyst图2 鼠体内包囊病理组织切片(HE)Fig.2 Cyst pathologic tissue section of rat (HE)

2.5ND1片段PCR检测

将所得10份疑似阳性结果样品再进行多房棘球蚴和细粒棘球蚴分型鉴别检测，其中2份样品经多房棘球蚴PCR得到目的片段，基因大小为395 bp(图4)，未检到细粒棘球蚴。PCR产物测序、Blast分析表明：该序列与GenBank中多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis，AB 720065.1)的ND1基因序列相似性达到100%。

M．DNA相对分子质量标准；1、2.Cox1基因目的条带；3.ddH2O阴性对照M.DL1000 DNA marker；1，2.PCR product of Cox1 gene；3.ddH2O as negative control图3 Cox1基因PCR结果Fig.3 The PCR result of Cox1 gene

M.DNA相对分子质量标准；1、2.ND1基因目的条带；3.ddH2O阴性对照M.DL2000 DNA marker；1，2.PCR product of ND1 gene；3.ddH2O as negative control图4 多房棘球蚴ND1基因PCR结果Fig.4 The PCR result of ND1 gene

2.6 统计学分析感染情况

经分子检测有10份样品为阳性，其中有8只携带包囊，总感染率达到2.60%。9只感染鼠样(8只大沙鼠、1只红尾沙鼠)均来自野外区感染率为2.74%(9/329)，1只感染鼠样(褐家鼠)来自城郊综合区感染率为2.38%(1/42)，城区感染率为0。10只阳性样本鼠：2只为多房棘球蚴(1只大沙鼠捕自野外区，1只褐家鼠捕自城郊综合区)；其余8只(7只大沙鼠及1只红尾沙鼠均为野外区捕获)与苏俄多房棘球蚴相似性为85%。不同鼠种感染率不同，其中大沙鼠感染率最高，较为易感，详见表2。

表2 感染率统计

Table 2 Infection rate statistics

鼠种Theratspecies数量Quantity感染数Numberofinfections感染率/%Infectionrate大沙鼠23083.48红尾沙鼠4512.22褐家鼠5411.85小家鼠1900灰仓鼠1600其他2000合计Total384102.60

3 讨 论

棘球蚴病由于流行范围广、危害大而备受关注。新疆作为棘球蚴病的重灾区，对该病的预防控制就显得尤为重要[6，14]。目前，临床上兽医对棘球蚴病传统常规诊断方法多为病理学诊断及血清学诊断。但病理学诊断在临床操作上往往参照病史、眼观、触诊、剖检、影像学等方法进行诊断，较为主观且易与肿瘤相混淆，不适用于早期和群体的诊断。现场剖检不但受调查者主观因素影响外，且包囊在不同发育状态下，某些包囊较小难以以肉眼与其他病变等分辨；而血清学诊断方法所用抗原主要来源于棘球蚴囊液(CF)，由于其成分复杂，与其他蠕虫病患畜的血清有交叉反应和非特异性反应，因此假阳性问题难以克服，诊断的特异性不理想[15]。在分子诊断中，PCR方法以其特异性强、可扩增病原靶标基因、灵敏度高等特点作为一种准确有效的病原学诊断方法逐渐运用于实践中[15-16]。本文结合剖检、病理组织学鉴定及分子生物学方法对病原体多方面进行判定。由于线粒体基因组已经在研究动物物种分类及虫种的鉴定等方面得到运用，通过PCR方法有效的对临床上易于混淆的带科绦虫的种、基因型等作出确切的鉴别和诊断[17]。本文选取棘球绦虫线粒体Cox1基因保守序列进行扩增测序，可扩增出棘球属条带。而后通过ND1等特异性基因序列对两种常见棘球绦虫基因序列进行扩增以期对其进行种属鉴别，来确定包囊病原体性质。

在本研究中，野鼠样品采集于口岸设立的城区、城郊综合区、野外区三大监测区域，对于口岸地区鼠类分布情况较具有代表性。由结果可得野外区、城郊综合区感染率分别为2.74%和2.38%，而城区未检测到病原体，可见野外区感染率较高，感染数量最多，占检测到感染数的90%，城郊综合区感染率次之。其中感染宿主多为大沙鼠，在本次检测中大沙鼠感染率可达3.48%。大沙鼠为口岸边境野外地区优势种，据尹小平等2011年对中哈边境地区进行的调查[18]，大沙鼠占该地区啮齿动物的60%～70%，且具有高繁殖力的特点，在疾病的传播过程中具有显著影响。本文中检测到10只感染鼠样，其中80%测序结果与2012年中国科学院西北高原生物研究所提交的苏俄多房棘球绦虫(Echinococcussp.)序列相似性最高，为85%，由于有多种带科绦虫以鼠类作为中间宿主[19]，则与Taenialaticollis、Taeniamadoquae进行比较其相似性均较次之。但目前除唐崇惕等1985—2007年报道过多次在内蒙古大兴安岭北麓开展鼠类和沙狐多房棘球绦虫感染调查研究发现苏俄多房棘球绦虫外，尚未有对大沙鼠携带苏俄多房棘球绦虫相关研究的具体报道，亦没有在新疆发现苏俄多房棘球蚴的相关报道[20]。大沙鼠是否为苏俄多房棘球绦虫的天然宿主还有待于研究证明。但为防止鼠类由野外区将携带的病原体传入城区，应持续对不同区域进行监测，并采取相应防控措施预防棘球蚴病的传播。

4 结 论

野生动物在棘球绦虫传播流行中起着重要的作用[7]，本研究通过PCR检测技术并结合病理组织形态学对阿拉山口口岸地区野鼠携带棘球蚴进行诊断调查和分析，显示野外区感染率最高，多数阳性野鼠样本可能感染泡状棘球蚴。而大沙鼠为口岸边境野外地区优势种，且感染率相对较高，需采取相应防控措施防止棘球蚴疾病的传播。

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(编辑 白永平)

Investigation on Echinococcosis in Wild Rodents at Ala-shankou Port

XIAO Yun-xia1，XU Xin-long2，YIN Xiao-ping2，WANG An-dong1，YAN Zun-xiang1，DUAN Cheng-ren3，XU Jun2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China；2.Ala-shankouEntry-exitInspectionandQuarantineBureauoftheP.R.China，Alashankou833418，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumchi830052，China)

The infectious status of echinococcosis in wild rodents was investigated at different areas of Alashankou Port.The wild rodent samples were collected from rural，suburb and urban area of Ala-shankou Port during 2013-2014.Then，pathological sections of liver were prepared and stained with H&E；the genomic DNA of livers and cysts were extracted.Cytochrome C oxidase 1 (Cox1)，NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) inEchinococcusmitochondria were amplified from the DNA and sequenced.Results were as follows：eight samples with cyst were found in the process of autopsy，and the positive rate was 2.08%.Ten positive samples were detected positive by PCR，and the positive rate was 2.60%.The analysis of Blast showed that 8 samples of our sequences were clustered with that ofEchinococcussp. (Accession No.JQ 690286.1)，and their identities were 85%.The remaining 2 samples of our sequences were clustered with that ofEchinococcusmultilocularis(Accession NO：AB 720065.1)，and their identities were 100%.The results of statitical analysis conveyed us the infection rates ofechinococcosisat rural and suburb area were 2.74% and 2.38%，respectively，while no positive sample was detected at urban area.The results presented here demonstrate that the wild rodents at rural area of Ala-shankou Port showed the highest infection rate，and its susceptible host was theRhombomysopimus.

echinococcosis；wild rodent；Ala-shankou Port

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.017

2014-10-28

国家质检总局科技计划项目(2014IK239)

肖云霞(1990-)，女，新疆乌鲁木齐人，硕士生，主要从事兽医卫生监督与管理研究，E-mail：18675016094@163.com

*通信作者：徐 军，高级兽医师，主要从事动物检疫研究，E-maill：alskxj@sina.com

S853.734

A

0366-6964(2015)06-1004-07