复方头孢泊肟酯纳米乳的研制及其药效与安全性研究

刘 岳，李梦云，郑 寅，高 娴，欧阳五庆，杨鸣琦

(西北农林科技大学 动物医学院，杨凌 712100)

复方头孢泊肟酯纳米乳的研制及其药效与安全性研究

刘 岳，李梦云，郑 寅，高 娴，欧阳五庆*，杨鸣琦*

(西北农林科技大学 动物医学院，杨凌 712100)

为研究头孢泊肟酯与牛至油在纳米水平的联合药效，首次制备复方头孢泊肟酯纳米乳并进行体外抑菌试验及急性毒性研究。在传统纳米乳制备方法筛选初步处方基础上，采用多指标正交试验法确定最优处方。以L9(34)正交表设计试验，以抑菌圈直径和纳米乳稳定常数Ke为考察指标，选择头孢泊肟酯和牛至油质量分数比(A)、纳米乳水相pH(B)、乳化温度(C)作为考察因素；体外抑菌试验采用微量肉汤稀释法；急性毒性试验采用最大耐受剂量法并进行了组织病理学检查。结果显示：针对致病性大肠杆菌、沙门菌最优处方为头孢泊肟酯0.33%、牛至油2.67%、1，2-丙二醇1.13%、EL-40 22.51%、蒸馏水73.36%，纳米乳pH值为6.17；与原料药相比，受试药物的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度差异显著(P<0.05)；小鼠经口急性毒性最大耐受剂量大于1 800 mg·kg-1，为低毒级药物，无肾、肠毒性，但可引起肝轻微病理损伤。结果表明，牛至油在纳米水平提高了致病性大肠杆菌、沙门菌、奇异变形杆菌、巴氏杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌对头孢泊肟酯敏感性。

头孢泊肟酯；牛至油；纳米乳

头孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil，CFP)作为口服，广谱，第三代头孢菌素类抗生素被广泛应用于治疗上呼吸道及尿路感染。130 mg头孢泊肟酯片剂口服(相当于100 mg头孢泊肟)在人体内的绝对生物利用度仅为50%。粪便中头孢泊肟酯仅为口服剂量的0.5%，这表明CFP作为酯类前体药物在肠腔发生了水解。研究表明CFP被肠壁酯酶水解为亲脂性差的活性代谢产物头孢泊肟，后者无法穿过生物膜，不利于肠道吸收，这被认为是CFP生物利用度较低主要原因之一；另外，头孢泊肟酯在水中极微溶解(400 μg·mL-1)，这严重影响了肠腔对药物的吸收[1-2]。

P.D.Preshita等[3]指出纳米技术为口服给药领域带来革命性变化，尤其对水溶性差和酶稳定性弱的口服药物效果显著。为有效阻止肠壁酯酶水解CFP并增加CFP在水中的溶解度，本试验综合纳米乳和头孢泊肟酯优势，采用传统纳米乳制备方法筛选出初步处方，采用多指标正交试验法设计试验得到抑菌效果好且稳定性高的最优纳米乳处方，通过比较发现牛至油(Origanum oil，OR)显著降低了CFP对多种革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)，故本研究拟将CFP和OR制备成复方纳米乳，以提高其抗菌效果。

1 材料与方法

1.1 仪器

BS214S电子天平，德国Satorius公司生产；JEM-1230型电子透射显微镜，日本JEOL公司生产；UV2450型紫外-可见分光光度计，岛津国际贸易(上海)有限公司生产。 Zetasizer Nano ZS型激光粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司生产。

1.2 主要试剂和药品

头孢泊肟酯原料药，湖北恒硕化工有限公司，纯度99%；牛至油原料药，武汉远成共创科技有限公司，质量分数98%；吐温-80(Tween-80)，天津市登封化学试剂厂，化学纯，批号：20121008；聚氧乙烯蓖麻油-40(EL-40)，批号：12120416；聚氧乙烯氢化蓖麻油-40(RH-40)，上海昌为医药辅料技术有限公司，化学纯，批号：210033；1，2-丙二醇(批号：3101885)，天津科密欧化学试剂开发中心，分析纯。

1.3 菌种

致病性大肠杆菌、沙门菌、奇异变形杆菌、巴氏杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌，由西北农林科技大学动物医学院微生物实验室提供。

1.4 CFP-OR-NE处方初步筛选及确定

油相：预试验参照参考文献[4]方法确定CFP在OR中的溶解度；表面活性剂：参考文献[5]筛选最优表面活性剂；增溶剂质量分数的确定：为进一步提高纳米乳对头孢泊肟酯的载药量，根据头孢泊肟酯的性质，选用1，2-丙二醇作为增溶剂，考察在体系中不同质量分数的1，2-丙二醇(1%、5%、10%)对纳米乳形成的影响。

根据上述筛选结果，将配方量的OR、1，2-丙二醇充分混合后，加入配方量的CFP，不断搅拌，待CFP完全溶解后，加入配方量的最佳表面活性剂，混合均匀后，逐滴加入配方量蒸馏水，直至体系经相变后最终稀薄且流动性如水一样时即筛选出CFP-OR-NE初步处方。

1.5 多指标正交试验筛选CFP-OR-NE最优处方

由预试验及参考文献[1，6]可知影响纳米乳抑菌效果和稳定性的因素有CFP与OR质量分数比(A)、水相pH(B)、乳化温度(C)，因素水平见表1。依据表1制备9个样品，编为试验号1～9，以9个纳米乳分别对鸡大肠杆菌和赛鸽仙台沙门菌抑菌圈直径、各纳米乳稳定常数Ke为评价指标；参照文献[7]，采用活菌平板计数法对菌液浓度进行计数。各所配菌液用生理盐水稀释为105cfu·mL-1备用。

1.5.1 抑菌圈直径测量 取100 μL稀释好的菌液(105cfu·mL-1)在普通平板上均匀涂布后，在平板上均匀打3个孔，每次取200 μL纳米乳打入孔内，置于4 ℃冰箱待药液扩散24 h，次日取出平板置于37 ℃下培养24 h用直尺量取抑菌圈直径，每个样品重复3次。药物对照为3%头孢克肟(cefixime，CFM)，后者与CFP同为第三代口服头孢菌素类，剂量及步骤同上。

表1 因素水平

Table1 Orthogonal factors and levels

水平Levels因素FactorsCFP∶OR(A)水相pH(B)pHofaqueousphase乳化温度/℃(C)Emulsionizingtemperature11∶11.22521∶43.03031∶86.835

1.5.2 纳米乳稳定常数的测定 乳剂物理稳定性常数计算公式如下：Ke=|A0-A|/A×100%。取2 mL纳米乳，4 000 r·min-1离心10 min，取最下层液体100 μL，试验号1～3稀释至含CFP/OR 20 μg·mL-1，试验号4～9稀释至含OR 30 μg·mL-1，以水为空白在纳米乳最大吸收波长处测定吸收度A；同法不经离心直接测定A0值。重复3次。

1.6 MIC和MBC测定

根据1.5筛选出的最优处方制备CFP-OR-NE，用蒸馏水稀释至含CFP 512 μg·mL-1备用；参考文献[8]方法用60%无水乙醇溶解并稀释CFP、OR及药物对照头孢克肟至512 μg·mL-1备用。采用二倍稀释法：在96微孔板第1孔加200 μL培养基作阴性对照，第2孔至第12孔依次加100 μL培养基后，在第2孔加100 μL药液反复吹打混匀后移取100 μL至第3孔依次倍比稀释至第11孔，从第11孔取出100 μL药液弃去，第12孔再加100 μL菌液作阳性对照。各药液各菌种重复3次；将所有完全清晰无细菌生长孔培养液分别接种普通营养琼脂平板，37 ℃培养24 h，菌落数不超过5个的最后一个平板对应的96孔板药液浓度为该药的MBC。

1.7 CFP-OR-NE质量评价

将CFP-OR-NE于4 000 r·min-1离心30 min，观察是否有浑浊、分层及药物析出等现象；将CFP-OR-NE分别于-20 ℃、4 ℃、室温和60 ℃下保存，于1、3、6个月后取样观察是否存在上述现象；纳米乳类型鉴别参照文献[7]方法；光稳定性、形态观察、粒径分析及Zeta电位测定试验参照文献[9]；长期试验，将CFP-OR-NE在(25±2) ℃相对湿度为60%±5%条件下放置12个月，于0、3、6、9、12个月观察和取样，观察性状并监测CFP和OR含量，分别建立两者含量—时间回归方程，计算药物有效期。

1.8 安全性评价

1.8.1 预试验 实验动物为健康小鼠，设10、100、1 000 mg·kg-13个剂量组，各以2只健康小鼠预试，雌雄各半。根据24 h内死亡情况，估计LD50的可能范围，确定正式试验的剂量组。

1.8.2 最大耐受剂量法(MTD试验) 健康小鼠20只，雌雄各半，观察3～5 d后，给予各小鼠最大灌胃容量0.4 mL·20 g-1，1日3次，连续观察14 d。

1.8.3 组织病理学检查 14 d后迅速解剖1.8.2给药小鼠，取其肝、肾、肠等组织块，10%中性福尔马林溶液(3.7%～4%中性甲醛)固定，4 ℃保存，常规制石蜡切片，HE染色。

1.9 纳米乳测定方法的建立

1.9.1 试验原理及测定波长的确定 参照文献[10]以双波长紫外分光光度法为基本原理，采用等吸收点法确定CFP的测定波长和参比波长；参照文献[11]以三波长紫外分光光度法为基本原理，以计算法确定OR测定组合波长。

1.9.2 供试液的制备 准确称取CFP原料药50 mg，加入1 mL乙腈，再用0.1 mol·L-1稀盐酸稀释至100 mL，得到500 μg·mL-1CFP储备液；准确称取1 g OR，加入100 mL无水乙醇溶解即制得500 μg·mL-1OR储备液；制备CFP、OR空白辅料供试液。

1.9.3 方法专属性试验 CFP原料药供试液用0.1 mol·L-1稀盐酸稀释至含CFP 20 μg·mL-1，CFP-OR-NE供试液用蒸馏水稀释至含CFP 20 μg·mL-1，CFP空白辅料稀释倍数同CFP-OR-NE即750倍；OR原料药、CFP-OR-NE分别用无水乙醇和蒸馏水稀释至含OR 20 μg·mL-1，OR空白辅料稀释倍数同CFP-OR-NE即750倍。采用紫外分光光度法在200～400 nm波长范围进行扫描，比较分析各紫外扫描图谱。

1.9.4 标准曲线的绘制 将CFP储备液用0.1 mol·L-1稀盐酸稀释成梯度浓度，用UV2450紫外-可见分光光度计在263和289.8 nm波长处测定其吸光度，将两波长下吸光度差值(△A)作为纵坐标，浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程；同法在261.6 、273.2 、284.4 nm波长处测定梯度稀释的OR储备液吸光度，获得回归方程。

1.9.5 回收率试验 用蒸馏水分别稀释试验号1～9至含CFP浓度为20、30、40 μg·mL-1，OR浓度为30、40、50 μg·mL-1并测量吸收值，每个样品重复测量3次，根据标准曲线方程，计算得出平均回收率及相对标准偏差(RSD)。

1.9.6 进样重复性试验与精密度试验 用蒸馏水分别稀释试验号1～9至含CFP质量浓度为20 μg·mL-1，OR质量浓度为40 μg·mL-1，重复6次，计算平均质量浓度和平均回收率及RSD；分别制备含CFP为2.5、7.5、12.5 μg·mL-1的CFP-OR-NE及含OR为30、40、50 μg·mL-1的CFP-OR-NE，在1、5、10、15、20、24 h进行日内精密度试验。选择一个固定时间每天测定，连续测定5 d进行日间精密度试验。

1.10 数据处理

1.5中评价指标数据用PASW Statistics 18 软件进行极差分析，确定影响各指标主次因素，确定CFP-OR-NE最优处方；1.5数据用PASW Statistics 18 软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 CFP-OR-NE处方筛选

2.1.1 油相确定 试验表明CFP在OR中溶解度达到500 mg·mL-1。

2.1.2 表面活性剂的确定 表面活性剂初选时Tween-80不能成乳，故在EL-40、RH-40、EL-40/RH-40质量比1∶1混合表面活性剂三者中选择。由图1可知，3种表面活性剂形成的纳米乳区的大小顺序：EL-40>RH-40>EL-40/RH-40(图1)。故选择EL-40作为CFP-OR-NE的表面活性剂。

2.1.3 增溶剂质量分数的确定 当1，2-丙二醇为10%时，不能形成纳米乳，当1，2-丙二醇为5%时，形成的纳米乳不稳定，因此选择增溶剂质量分数为1%，经进一步精确试验确定1，2-丙二醇质量分数为1.13%。

图1 表面活性剂对纳米乳形成的影响Fig.1 Effect of surfactant agents on nanoemulsion region

2.1.4 初步处方的确定 CFP-OR-NE初步处方各组分质量分数：CP 1.5%、牛至油1.5%、EL-40 22.51%、1，2-丙二醇1.13%、蒸馏水73.36%。按上述配方结合1.4方法制备初步CFP-OR-NE。

2.2 确定CFP-OR-NE最优处方

试验方案及试验结果见表2。筛选抑制大肠杆菌最优处方：对于因素A，其对大肠杆菌抑菌圈直径影响大小排第1位，取A1；其对Ke影响大小也排第1位，取A3，因此A可取A1或A3，但取A3时纳米乳稳定性比取A1提高82.86%，而抑菌圈直径仅缩小50.01%，故A取A3，B对抑菌圈直径影响大小排第2位，在Ke中排第3位，故以抑菌圈直径为主B取B2，同理C取C2；筛选抑制沙门菌最优处方分析方法同上，确定A取A3，B取B2，C取C2，故抑制两种细菌优组合同为A3B2C2，据此制备CFP-OR-NE。

2.3 MIC和MBC测定

CFP-OR-NE体外抑菌试验结果见表3。

2.4 质量评价

各温度下保存的CFP-OR-NE在1、3、6月均为澄清透明且无分层现象；离心试验和光照试验CFP-OR-NE稳定，无分层、絮凝、转型、破乳、酸败等现象；染色结果显示CFP-OR-NE为O/W型；经透射电镜观察CFP-OR-NE乳滴呈圆球形，分布均匀，见图2；粒径分析结果表明，CFP-OR-NE平均粒径为18.94 nm，多分散系数(PDI)为0.258，见图3；在环境温度25 ℃条件下，Zeta电位为-9.96±6.35 mv(pH为6.39)。

表2 试验方案及试验结果

Table 2 The test scheme and test results

试验号Testnumber因素Factors评价指标(x-±s)Evaluationindex(x-±s)A(CFP∶OR)B(水相pH)B(pHofaqueousphase)C(乳化温度/℃)C(Emulsifytemperature)D(空列)D(Nullcolumn)抑菌圈直径/mmInhibitoryzonediameter致病性大肠杆菌EnteropathogenicE.coli沙门菌Salmonella稳定常数Ke11 (1∶1)1 (1.2)1 (25)139.67±2.8932.33±0.5815.32±0.5621 (1∶1)2 (3.0)2 (30)238.67±0.5828.33±0.589.20±0.4831 (1∶1)3 (6.8)3 (35)339.67±2.0831.00±1.0036.20±2.3642 (1∶4)1 (1.2)2 (30)331.00±1.0025.00±1.006.17±0.9052 (1∶4)2 (3.0)3 (35)129.67±1.5321.67±1.533.05±0.6962 (1∶4)3 (6.8)1 (25)229.33±0.5827.67±0.582.12±0.6273 (1∶8)1 (1.2)3 (35)225.67±0.5817.33±0.581.48±0.2783 (1∶8)2 (3.0)1 (25)328.67±0.5824.33±0.586.79±0.4893 (1∶8)3 (6.8)2 (30)126.00±1.0021.33±1.162.14±0.27致病性大肠杆菌抑菌圈直径InhibitoryzonediameterofenteropathogenicE.coli沙门菌抑菌圈直径InhibitoryzonediameterofSalmonella稳定常数KeK1118.0196.3495.0091.6674.6684.3360.7222.9724.23K290.0097.0195.6774.3474.3374.6611.3419.0417.51K378.6795.0095.0162.9980.0070.0010.4140.4640.73k139.3432.1131.6730.5524.8928.1120.247.668.08k230.0032.3431.8924.7824.7824.893.786.355.84k326.2231.6731.6721.0026.6723.333.4713.4913.58R13.120.670.229.551.894.7816.777.147.74因素主次水平PrimaryandsecondarylevelfactorsA>B>CA>C>BA>C>B优水平OptimumlevelsA1B2C2A1B3C1A3B2C2优组合OptimumcombinationA1B2C2A1B3C1A3B2C2

试验号1～9 CFP和OR质量分数之和均为纳米乳体系的3%；药物对照2：3%头孢克肟，对致病性大肠杆菌抑菌圈直径(27.33±2.52)mm，对沙门菌抑菌圈直径(27.67±1.16)mm

The sum of CFP and OR in test No.1-9 all account for 3% of system of nanoemulsion；Inhibitory zone diameters of 3% of cefixime as positive control of drug are 27.33±2.52 mm for enteropathogenicE.coliand 27.67±1.16 mm forSalmonella，respectively

长期试验结果(表4)，各时间点纳米乳均为澄清透明淡黄色液体。CFP含量—时间回归方程为y=-0.428x+100.04(R2=0.989)，CFP的时间有效期为23.45个月；OR含量—时间回归方程为y=-0.467x+100.05(R2=0.982)，OR的时间有效期为21.52个月；故CFP-OR-NE的有效期为21个月。

图2 透射电镜下CFP-OR-NE的形态(50 000×)Fig.2 Shape of CFP-OR-NE under the transmission electron microscope(50 000×)

2.5 安全性评价

2.5.1 急性毒性试验 预试验结果：各试验组小鼠24 h内均未死亡，CFP-OR-NE的LD50不可测，因此对CFP-OR-NE采取MTD试验；MTD试验结果：连续观察7～14 d，灌胃后2 d小鼠出现不同程度精神萎靡，食欲不振等现象，灌胃后3 d均恢复正常，小鼠未出现死亡，CFP-OR-NE对小鼠经口急性毒性最大耐受剂量大于1 800 mg·kg-1。

图3 CFP-OR-NE粒径分布Fig.3 Droplet size distribution of CFP-OR-NE

2.5.2 组织病理学检查 与对照组相比，给予小鼠最大耐受剂量CFP-OR-NE时，试验组肾及小肠组织结构无明显变化(图4d和图4f)，可初步认为CFP-OR-NE没有肾毒性及肠毒性；试验组肝，轻微出血，少许细胞变性坏死，分界不清(图4e)，但未引起小鼠死亡。

a.对照组肾；b.对照组肝；c.对照组小肠；d.试验组肾，肾小管上皮细胞排列整齐，管腔清晰可见；e.试验组肝，轻微出血，少许细胞变性坏死，分界不清；f.试验组小肠，上皮细胞排列整齐，结构完整，小肠腺发达a.The kidney of control group；b.The liver of control group；c.The small intestine of control group；d.The epithelial cells of renal tubule arrange neatly and the cavity of renal tubule show visibility in the kidney of test group；e.A small amount of liver cells show minor bleeding，degeneration，necrosis，and unclear boundaries in test group；f.The small intestine epithelial cells arrange neatly，showing structural integrity and developed intestinal glands图4 56日龄小鼠肾、肝和小肠(HE，400×)Fig.4 The kidney，liver and small intestine of mouses at 56 days of age(HE，400×)

2.6 方法专属性试验

由图5、6可见，CFP和空白乳的最大吸收峰分别为263和234.8 nm，空白乳在CFP最大吸收峰处有一定的吸收。用UV2450 选点检测功能确定空白乳等吸收点波长为289.8 nm。选择263 nm为CFP检测波长，289.8 nm为参比波长。确定OR测定组合波长为261.6、273.2、284.4 nm。

2.7 标准曲线的绘制

CFP和OR分别在各自含量测定线性范围线性良好(表5)。

2.8 回收率试验

平均回收率符合70%～110%[12]的要求(表6)，证明运用多波长紫外分光光度法建立CFP-OR-NE有效成分含量分析方法准确度高，适用于该药质量控制。

2.9 进样重复性试验与精密度试验

各试验号CFP及OR测定的RSD均小于0.6%，进样重复性良好，见表7。CFP-OR-NE中CFP和OR测定的日内、日间精密度RSD均小于5%，日内日间精密度良好，见表8。

1.CFP原料药；2.CFP-OR-NE；3.CFP空白辅料1.CFP drug;2.CFP-OR-NE;3.Blank excipients of CFP图5 CFP相关紫外吸收图谱Fig.5 The UV absorbance spectrum on CFP

1.OR原料药；2.CFP-OR-NE；3.OR空白辅料1.OR drug;2.CFP-OR-NE;3.Blank excipients of OR图6 OR相关紫外吸收图谱Fig.6 The UV absorbance spectrum on OR

表5 CFP和OR含量测定线性方程

Table 5 Linear equations of measurement of CFP and OR concentrations

药物Drug线性方程Linearequation相关系数(r2)Correlationcoefficient线性范围/(μg·mL-1)LinearrangeCFPA=0.01041C+0.002730.999221～100ORA=0.00746C+0.000470.999701～100

%

%

组别Group质量浓度/(μg·mL-1)Concentration日内精密度Intra-dayprecision日间精密度Inter-dayprecisionx-±sRSDx-±sRSD2.52.37±0.020.972.37±0.031.39CFP7.57.52±0.070.967.47±0.121.6112.512.88±0.060.4712.78±0.161.253030.64±0.180.5929.59±1.254.22OR4040.83±0.210.5139.39±1.624.115050.65±0.340.6749.76±1.412.83

3 讨 论

试验选择的水相pH、CFP载药量、乳化温度三个因素对CFP-OR-NE稳定性影响存在内在联系，推测三者均通过调整表面活性剂有效浓度影响纳米乳稳定性。A.A.Date等[1]报道的CFP自乳化释药系统在pH1.2缓冲液中最为稳定，本试验分别用pH3.0和pH1.2水相制备纳米乳，发现前者稳定性高于后者。说明CFP在中强酸度水相酸性条件下所形成的纳米乳理化性质最为稳定，CFP-OR-NE的最终pH为6.17，符合口服乳剂相关要求；本试验表明CFP载药量越高，纳米乳越不稳定，试验结果与A.A.Date等[1]报道一致，分析原因为部分CFP定位在油相与表面活性剂界面干扰了OR与表面活性剂的充分作用，降低了表面活性剂有效浓度。值得注意的是水相pH和CFP载药量对纳米乳稳定性影响可能并不是孤立的，由于CFP在酸性条件下溶解度增加，水相pH为3.0时位于混合界面的CFP可能向水相移动，相对增加了表面活性剂的有效浓度，使纳米乳趋于更加稳定；试验表明最适乳化温度为30 ℃，25 ℃温度偏低，界面张力降低效果有限，而35 ℃温度偏高部分EL-40聚氧乙烯链与水之间的氢键可能发生断裂，降低了表面活性剂有效浓度，纳米乳稳定性亦不高。

研究表明某些表面活性剂如Tween-20胶束溶液具有阻止肠壁酯酶水解CFP作用，机制为CFP进入Tween-20胶团核心，且聚山梨醇酯类表面活性剂本身对肠壁酯酶有抑制作用[2，15]。本试验制备的CFP-OR-NE从胶束增溶理论分析可认为是EL-40胶束溶液增溶之后形成的，即CFP溶解在OR中作为油相增溶于EL-40胶束溶液，推测EL-40和OR的双重保护可有效阻止肠壁酯酶将CFP水解为亲脂性差的CPD，有效促进肠腔对CFP的吸收。

本试验发现各受试菌对CFP-OR-NE的敏感性与对CFP和OR的敏感性相比相差显著(P<0.05)，推测EL-40和OR的表面活性和脂溶性增加了CFP对细菌细胞膜的渗透作用，从而极大地降低了各受试菌对CFP的MIC及MBC。CFP-OR-NE的抗菌谱广泛，且CFP质量分数仅为0.33%，将OR与CFP联合应用极大地减少了CFP用量，对于减少各受试细菌临床耐药菌株的产生具有重要意义。ORI为天然植物抗生素具有单药不产生耐药性、与目前使用的抗生素和合成抗菌药无交叉耐药性等优点[13-14]。本试验为CFP与OR在临床上的联合应用奠定了一定的基础。测定了CFP-OR-NE对常见致病性细菌的MIC和MBC，为CFP-OR-NE的药效学研究提供了基础数据。

组织病理学检查给予小鼠最大给药剂量未见肾、肠毒性，虽可引起肝轻微病理损伤，但未致小鼠死亡。本试验制备的CFP-OR-NE对小鼠的经口急性毒性最大耐受剂量大于1 800 mg·kg-1，CFP-OR-NE为低毒级药物[16-18]，肝轻微出血可能为脱颈致死小鼠未放血引起，少许肝细胞变性的原因可能为药物的首过效应。本试验首次运用多波长紫外分光光度法，针对自制CFP-OR-NE中CFP和OR的含量测定建立了分析方法，CFP和OR平均回收率均在70%～110%的一般要求范围内[12]，通过此法对CFP-OR-NE进行质量监测得出有效期为21个月，结合质量评价其他试验结果说明CFP-OR-NE稳定性高。

4 结 论

首次制备出CFP-OR-NE，且质量评价符合规定要求；体外抑菌试验表明OR显著降低CFP对各受试菌的MIC及MBC；MTD试验表明CFP-OR-NE为低毒药物，组织病理学检查无肾、肠毒性；采用多波长紫外分光光度法成功建立了纳米乳中有效成分含量分析方法，实现了CFP-OR-NE的质量监测，计算出其有效期为21个月。

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(编辑 白永平)

Preparation，Efficacy and Safety Evaluation of Compound Nanoemulsion of Cefpodoxime Proxetil

LIU Yue，LI Meng-yun，ZHENG Yin，GAO Xian，OUYANG Wu-qing*，YANG Ming-qi*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

To study the efficacy of combined application of cefpodoxime proxetil and Origanum oil in nanoscale level，compound nanoemulsion of cefpodoxime proxetil was innovatively prepared.Furthermore，antibacterial activity tests in vitro and acute toxicity tests were conducted.Preliminary prescription was sieved on the base of traditional method of preparation of nanoemulsion.Then the multi-index orthogonal experiment was proceeded with L9(34) orthogonal test table，regarding bacteriostatic circle diameter and nanoemulsion stability constantKeas examining index.Three elements，ratio of the mass fraction of cefpodoxime proxetil and Origanum oil，pH of aqueous phase and emulsifying temperature are selected as factors.Antibacterial activity testsinvitroand acute toxicity tests were done through trace broth dilution method and maximal tolerance dose test.Then histopathological examination was measured.The optimal prescription is composed of 0.33% of cefpodoxime proxetil，2.67% of Origanum oil，1.13% of 1，2-propylene glycol，22.51% of EL-40，73.36% of distilled water for enteropathogenicE.coliandSalmonellaand pH value of nanoemulsion is 6.17.Compared with the active pharmaceutical ingredients，both of the minimum inhibitory concentrations and minimum bactericidal concentrations of test drug were significantly different(P<0.05)；the maximum tolerated dose of the oral acute toxicity of mice is higher than 1 800 mg·kg-1，showing low toxicity.Histopathological examinations show no toxicity of kidney and small intestine，but can do pathological damage to the liver.When in the presence of Origanum oil，enteropathogenicE.coli，Salmonella，Proteusmirabilis，Pasteurella，Shigelladysenteriae，Staphylococcus，Streptococcusagalactiaeare more sensitive to CFP-OR-NE than cefpodoxime proxetil.

cefpodoxime proxetil；Origanum oil；nanoemulsion

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.020

2014-09-09

农业科技成果转化资金项目(2013GB2G000475)

刘 岳(1989-)，男，黑龙江齐齐哈尔人，硕士生，主要从事动物病理学研究，E-mail：aizaidangxia@yeah.net

*通信作者：欧阳五庆，E-mail：oywq506@sina.com；杨鸣琦，E-mail：xbndymq@163.com

S859.5

A

0366-6964(2015)06-1026-11