犬瘟热疫苗研究进展

摘 要：犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）感染犬和其他食肉动物引起的一种病死率高的接触性传染病。近年来暴发了多起犬和野生动物自然感染犬瘟热病毒的案例。目前尚无治疗犬瘟热的有效药物或生物制剂。犬瘟热的预防主要依靠接种疫苗，应用最为广泛的是弱毒活疫苗，但也存在一些问题。论文主要概述了犬瘟热弱毒活疫苗、基因疫苗、病毒载体疫苗的研究进展，以期为研制安全、高效的犬瘟热新疫苗提供参考。

文献标识码：A

文章编号：1007－5038（2015）10－0085－05

收稿日期：2015－03－25

基金项目：吉林省科技发展计划基金项目（20140307002NY）

作者简介：薛向红（1985－），女，山西吕梁人，助理研究员，博士，主要从事毛皮动物传染病病原与疫苗研究。＊通讯作者

犬瘟热（Canine distemper，CD）是犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）侵害犬等食肉动物引起的一种急性、热性、接触性传染病。该病传染性强，发病率高，临床症状多样性，感染动物后期免疫力骤降，容易继发混合感染和二次感染，致死率高。犬瘟热病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属成员，是单股负链不分节段RNA病毒。其基因组大小为15 690bp，从3′到5′端依次编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大转录蛋白（L）。其中，H蛋白介导CDV与宿主细胞相应受体结合，使病毒黏附到宿主细胞表面；F蛋白介导病毒与感染细胞、感染细胞与非感染细胞的融合，使病毒进入宿主细胞并得以散播。H和F蛋白是刺激机体产生保护性中和抗体的重要抗原。

近20年来，随着人类对野生动植物资源的开发利用，野生动物栖息环境发生了改变，加上病毒自身的不断演化，CDV的自然宿主从最初的犬科动物（Canidae）不断扩大至猫科（Felidae）、鬣狗科（Hyaenidae）、鼬科（Mustelidae）、浣熊科（Procyonidae）、熊科（Ursidae）、灵猫科（Viverridae）、熊猫科（Ailuridae）和臭鼬科（Mephitidae）动物 ［1］。CD的流行对犬、毛皮经济动物、野生动物的生命安全造成了严重威胁，给养殖户造成巨大的经济损失。野生动物老虎、狮子、豹和海豹等，甚至一些珍稀物种如大熊猫、小熊猫等都暴发过犬瘟热。2015年1月陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心圈养的大熊猫感染CDV强毒株，死亡4只。实际上，已经有CDV自然感染非人灵长类动物如我国的猕猴和日本的食蟹猴的报道 ［2－3］。人的变形性骨炎（Paget＇s）患者体内检测到了CDV的核酸 ［4］，这提示犬瘟热有可能成为人兽共患传染病，因而该病引起了国内外学者的高度关注。本文就CD疫苗的研究进展进行概述，以期为研制安全、高效的CD疫苗提供参考。

1 传统疫苗

1．1 灭活疫苗

Puntoni最先利用福尔马林灭活感染CDV的犬脑组织，制备了组织灭活苗，接种犬后，当其体内中和抗体滴度小于1∶20时，能产生较弱的抵抗强毒攻击的免疫反应，但此类疫苗无法有效地控制犬瘟热。夏咸柱等用静水压高压方法灭活CDV后，以蜂胶为佐剂制备的CD灭活疫苗，诱导犬产生中和抗体的能力明显高于福尔马林灭活苗，临床应用结果表明，该疫苗对犬的保护率达89% ［5］。犬瘟热蜂胶组织灭活苗能使水貂产生与弱毒苗同等效力的免疫反应，免疫后8个月内对水貂具有100%保护，可用于紧急接种，预防水貂犬瘟热暴发。由于CD灭活苗激发产生的抗体水平下降快，仅诱导体液免疫，抗体持续时间短，疫苗免疫原性差等缺点，现已很少使用。

1．2 弱毒活疫苗

弱毒活疫苗（modified live vaccine，MLV）株是将自然分离的犬源、貂源CDV经鸡胚、细胞多次传代适应而致弱，它们对犬有较高的安全性，能刺激机体产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，诱导免疫记忆，具有良好的免疫原性。好的弱毒活疫苗既要对易感动物具有较高的安全性，又要具有良好的免疫原性，可以激发机体产生强有力的抗体反应和细胞应答。19世纪50至60年代，CD弱毒活疫苗研制成功，它的广泛应用极大地降低了犬群中CD的发病和流行。犬用商业疫苗几乎都是多联疫苗，除CDV外，还包含犬细小病毒、灭活的狂犬病病毒、犬肝炎病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒或犬钩端螺旋体等。犬用CDV标准弱毒疫苗株主要有Onderseport、Lederle、Convac和犬肾细胞适应株Rockborn。自1977年以来，我国先后从国外引进的CD弱毒疫苗中分离获得美国株、法国株和前苏联株等犬瘟热弱毒疫苗株，其中CDV／R－20／8株是国产犬用五联弱毒疫苗或六联弱毒疫苗所用的犬瘟热病毒株。其他毛皮动物的犬瘟热弱毒疫苗主要是单苗，市售的水貂用犬瘟热毒株为CDV3和CDV－11株。将这些弱毒活疫苗制成冻干苗和湿苗，应用于犬或其他易感动物，取得了很好的免疫效果，有效控制了犬群中犬瘟热的暴发和流行。为了提高CD MLV的免疫效果，有学者以合成的阳离子脂肽Pam3CSK4和PHCSK4为佐剂，经雪貂体内试验，表明其能够增强麻疹病毒（Mealse virus，MeV）和CD弱毒活疫苗的免疫效果 ［6］。CD弱毒活疫苗接种犬时，肌肉和静脉注射效果要优于皮下注射效果，除非紧急接种，一般不提倡静脉途径 ［7］。为避免新生犬中CDV母源抗体的干扰，幼犬断奶后2周～3周进行接种犬瘟热弱毒活疫苗，这个时候母源抗体基本消退，不会影响免疫效果。

虽然犬瘟热弱毒活疫苗的使用曾经大大减少了CDV对大批犬的感染，但是它们对野生动物不同程度地致病性值得人们深思。目前，犬和野生动物中暴发CD的案例逐年增多，有研究表明，国内流行犬瘟热野毒株与商业疫苗毒株的抗原蛋白存在较大差异 ［8］。因此，需要考虑现行使用的犬瘟热弱毒疫苗是否能够预防不断变异、自然宿主不断扩大的犬瘟热病毒感染，研制既有高安全性又有良好免疫原性的MLV具有重要的实际意义。

2 基因疫苗

基因疫苗（DNA疫苗）的显著特点在于其不含病原成分，安全、纯度高。Sixt N等最早构建的CDV H、F的重组DNA，混合或单独在小鼠体内均能诱导高水平中和抗体。试验表明，CDV弱毒株的H基因疫苗在水貂体内也能激发产生强烈的体液免疫反应，而且攻毒后，抗病毒因子IFN－γ的含量迅速增加 ［9］。这都辅助证明，CDV H和F蛋白是重要的保护性抗原。强毒A75／17株的N、F和H基因重组质粒接种小鼠，证明DNA疫苗能诱导CTL反应；比格犬体内试验表明，免疫犬攻毒后，虽能在体内检测到病毒增殖，但最后得以存活。首次证明CD DNA疫苗能保护CDV敏感动物犬抵抗强毒攻击 ［10］，推测其保护依据是，攻毒时，强烈刺激了免疫犬体内的免疫记忆细胞，在短时间内诱导产生了大量特异性中和抗体，其他DNA疫苗免疫研究也证明了这一点 ［9－11］。因此，无论CDV强毒株还是弱毒株，其囊膜蛋白基因疫苗都可以在易感动物体内诱导体液反应，攻毒后刺激免疫记忆细胞迅速活化，分泌大量IFN－γ，发挥抗病毒效应 ［11］。经皮内或肌肉途径给水貂注射CD DNA疫苗，水貂都产生了特异性中和抗体，抵抗了强毒攻击 ［12－13］。经哺乳动物密码子优化后的CDV F、H、M、N基因的重组DNA混合接种犬，发现含CDV－N组的抗体滴度比不含CDV－N组的加强免疫后显著升高，峰值可达到26．54，很可能是N蛋白上的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位刺激机体产生了免疫记忆细胞的缘故；初免后第54周犬体内CDV抗体维持在2 6［14］，可见密码子优化后的抗原基因免疫效果良好。聚乙烯胺（PEI）同CDV中国分离株YZ0101的H、F和N的重组质粒联合免疫比格犬，三免后抗体滴度为101．75±0．190，未达到临界保护线10 2。但攻毒后，免疫组经过一过性体温升高，第18天外周血淋巴细胞CDV检测为阴性，之后免疫犬存活。而且，PEI佐剂组比裸DNA组的免疫效果稍好，可见，PEI协同或增强了细胞免疫。其他病毒DNA免疫研究中也有类似报道，攻毒前免疫动物体内的抗体滴度未达到保护线，但仍能抵抗相应的强毒攻击。因此，DNA免疫中细胞免疫和抗体记忆效应对免疫保护非常重要 ［15］。大熊猫源GM－CSF的重组质粒在小鼠体内增强了CDV N基因疫苗的免疫效果，外周血中IL－4和IFN－γ含量增加 ［16］。犬瘟热DNA疫苗另一个显著的优势在于，能够克服幼龄动物体内母源抗体的干扰，从而发挥免疫效应。幼龄水貂体内研究表明，存在母源抗体时，DNA疫苗能够激发机体产生免疫反应，CDV H基因疫苗比H、F和N基因疫苗混合免疫的保护效果好 ［17］。但是，限制DNA疫苗应用的重要原因是其诱导产生的抗体水平比较低。

3 亚单位疫苗

国内外研究者构建了CDV主要抗原蛋白的原核／真核表达系统，但CDV亚单位疫苗实际应用的报道很少。徐向明等在大肠埃希菌中高效表达CDV囊膜蛋白H、F，回收后免疫小鼠，获得的抗血清能与感染CDV的细胞特异地结合，混合免疫后能诱发机体产生1∶16的中和抗体，验证了囊膜蛋白是保护性抗原，具有良好的免疫原性 ［18］。王亚君等利用杆状病毒表达系统共表达CDV F蛋白上重要的辅助性T、B细胞抗原表位（T＇TB）和犬细小病毒VP2蛋白，免疫小鼠产生了抗CDV和CPV的特异性抗体，这为同时预防犬瘟热和犬细小病毒病的新型亚单位疫苗的研制奠定了重要基础 ［19］。

4 病毒载体疫苗

病毒作为疫苗载体，分为复制型和复制缺陷型，复制型病毒载体疫苗能引起强烈和持久的免疫反应，但是该疫苗不适合免疫力低下的个体使用。复制缺陷型载体相对安全些，需要大剂量才能达到最佳的免疫效果。

4．1 痘病毒载体疫苗

犬接种MeV疫苗后，虽然体内检测不到抗CDV抗体，但能抵抗CDV感染。近期在食蟹猴的试验表明，给接种MeV疫苗的食蟹猴攻CDV强毒后，能够获得部分保护，体内抗MeV特异性抗体水平迅速升高，白细胞明显增多 ［20］。可见，同种属的MeV和CDV间具有交叉保护作用。表达MeV N、M和F蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠受到CDV攻击时，部分获得保护；只表达F蛋白时，保护率为100% ［21］。犬接种表达MeV H或／和F蛋白的重组痘病毒后，攻击CDV强毒，发现单独接种了表达MeV F的重组痘病毒的犬出现了一过性犬瘟热症状，但最后得以存活 ［22］。金丝雀痘病毒在犬体内无法复制，犬接种表达MeV H和F蛋白的重组金丝雀痘病毒后能抵抗CDV致死性攻击 ［23］。因此，无论以复制型还是复制缺陷型病毒为载体表达MeV保护性抗原的重组病毒都能够抵抗同种属的CDV强毒攻击，这也证明了MeV和CDV的主要保护性抗原间具有交叉免疫保护作用。减毒牛痘病毒NYVAC或金丝雀痘病毒ALVAC在哺乳动物体内不能高效复制，幼年雪貂接种以它们为载体表达CDV H和F蛋白的重组病毒后，产生了高水平中和抗体（≥1∶96），攻毒后没有出现犬瘟热症状，而弱毒苗组则呈现一过性体重下降。其他类似研究证明，重组金丝雀痘病毒疫苗对大熊猫 ［24］、西伯利亚艾鼬、狐獴 ［25］及雪貂等CDV易感物种都是安全的。而且，与CDV弱毒活疫苗相比，复制缺陷的重组金丝雀痘病毒诱导产生的免疫反应更为温和，适用于存在母源抗体的幼龄动物 ［26］。在美国，重组金丝雀痘苗病毒CDV疫苗现已投入实际应用。

4．2 腺病毒载体疫苗

目前尚无可以有效克服幼龄动物母源抗体干扰的CDV疫苗。重组CDV H、F的复制完全型腺病毒CAV－2经犬鼻内黏膜免疫，能激发CDV抗体阴性且CAV－2抗体阳性的犬产生体液免疫并达到保护水平。但是，当动物体内处于CDV母源抗体阳性和CAV抗体阳性时，该免疫途径无法激发有效的特异性免疫应答。改为皮下接种时，机体产生了抗CDV特异性免疫应答 ［27］。葛艳华等 ［28］成功构建了表达Asia－1型CDV分离株HLJ2－07H蛋白的重组犬腺病毒2型载体。鞠会艳等完成了CDV N基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达 ，并构建了表达CDV H的重组腺病毒 ［29］。与DNA疫苗相比，重组CDV腺病毒可以经口服和肌肉等多种途径免疫，尤其是对于凶猛的野生动物。犬免疫试验表明，重组CDV腺病毒联合DNA疫苗的免疫效果优于各自单独免疫，但都不如CDV弱毒苗的效果 ［30］。王胜乐等 ［31］构建了犬瘟热重组腺病毒疫苗CAV－CDV－H 和CAV－CDV－F，在水貂上的试验结果显示，CAVCDV－H组的免疫效果最好，存活率为100%；其次是等剂量CAV－CDV－H和CAV－CDV－F免疫组的；CAV－CDV－F组的免疫效果最差。这也证明CDV H蛋白是主要保护性抗原，而F蛋白也能刺激机体产生一定水平的抗体。

4．3 其他病毒载体疫苗

随着体外转录技术的发展，反向遗传学技术为新型犬瘟热疫苗的研发提供了强有力的工具。利用反向遗传学技术，将eGFP基因插入CDV L基因中能够使病毒致弱，重组病毒有潜力成为弱毒活疫苗候选株 ［32］。删除H蛋白N端的所有糖基化位点可以致弱CDV野生毒株 ［33］。表达CDV野毒株H蛋白的重组MeV，接种雪貂后不引起任何临床症状或免疫抑制，能激发机体产生抗CDV抗体，且能够抵抗CDV强毒攻击 ［34］。这表明MeV和CDV存在交叉保护。表达CDV H和F蛋白的重组新城疫病毒rLa－CDV－F和rLa－CDV－H在小鼠和犬体内都能诱发保护性中和抗体，但单独rLa－CDV－H的免疫效果优于单独rLa－CDV－F的和两种联合免疫的。这表明H蛋白是重要的保护性抗原 ［35－36］。表达狂犬病病毒（RV）糖蛋白G的rCDV－RVG对小鼠和犬都是安全的，在犬体内能同时持久地激发高水平抗RV和抗CDV抗体 ［37］，有希望用作犬二联苗。同样地，表达CDV H蛋白的重组狂犬病病毒LBNSE－CDVH株对犬具有安全性，并能激发抗RV和抗CDV中和抗体，有潜力用于研发野生动物二联疫苗 ［38］。CDV具有免疫细胞趋向性，因此研究人员将其作为载体表达SIV囊膜蛋白，CDV－SIV经鼻内免疫雪貂，能够安全诱导雪貂产生抗SIV囊膜蛋白的ELISA抗体以及抗CDV中和抗体 ［39］。王磊等 ［40］利用反向遗传技术构建了双H蛋白的重组犬瘟热病毒，在犬体内激发的中和抗体滴度比亲本毒株的高出2倍～3倍。为了增强CD疫苗的细胞免疫应答和其抗病毒作用，刘玉秀等构建了表达鼠源／犬源IL－18的重组CDV，两株重组病毒都能在细胞水平表达成熟型IL－18，并能刺激犬或鼠免疫细胞分泌IFN－γ ［8］。

5 小结

随着CDV不断变异，自然感染宿主不断扩大，对犬、野生动物和毛皮动物的生命安全带来了巨大威胁。弱毒活疫苗虽然极大地降低了犬群中犬瘟热的发病和流行，但它对野生物种致病的风险值得重视。核酸疫苗克服了母源抗体的干扰具有一定的保护效果，但激发的抗体水平比较低。核酸疫苗配合弱毒活疫苗的免疫研究比较多。犬瘟热病毒的流行毒株同商业疫苗株主要抗原蛋白的分子差异较大。基于人们对CDV基因组结构、感染和复制机制及其疫苗的深入研究，基因工程疫苗是目前研究的热点，效果良好。因此，充分利用基因工程技术，研制安全、高效、成本低廉的犬瘟热疫苗或其他新型病毒免疫制剂对预防、控制国内犬瘟热疫情蔓延具有重要实际意义。