黑茶中茶多酚的醇水-超临界CO2流体联合提取

尹志芳,彭晓赟,杨宇强,谢 文,赵运林

(湖南城市学院化学与环境工程学院,湖南益阳 413000)



黑茶中茶多酚的醇水-超临界CO2流体联合提取

尹志芳,彭晓赟,杨宇强,谢 文,赵运林*

(湖南城市学院化学与环境工程学院,湖南益阳 413000)

以自制黑茶为研究对象,分别采用超临界CO2萃取法、醇水浸提法及醇水浸提-超临界CO2联合萃取法对茶样中的茶多酚进行提取,用正交实验法优化了提取条件,以没食子酸为标准品,在765nm处用紫外可见分光光度法检测产品中茶多酚的含量,计算了茶多酚的得率及萃取样中产品的纯度,并对三种产品的DPPH·清除率进行了比较。结果表明:3种方法中醇水-超临界CO2联合萃取法的得率和纯度最高。联合浸提最优条件为:先用乙醇浓度80%,料液比1∶10g/mL,60℃下浸提2.0h,然后25MPa,50℃下超临界CO2萃取时间2h。茶多酚的得率为6.36%±0.81%,产品纯度为:41.22%±3.19%。产品对DPPH·的清除率为90.64%±0.0187%。该方法绿色环保,未添加任何有害溶剂,为黑茶饮品的进一步研究开发提供参考。

黑茶,茶多酚,超临界CO2,联合提取

茶多酚是茶叶中多羟基酚类化合物的总称,由儿茶素类、黄酮甙类、花青甙类、酚酸类、缩酚酸类等30多种化学物质组成,也是一种天然的无毒抗氧化剂。对食品、化妆品、保健品具有优异的抗氧化能力和防腐保鲜作用的功能已被大家所熟知,许多发达国家把这种天然的抗氧剂作为化学抗氧剂的最佳替代品,已广泛用作各类食品添加剂[1]。

目前茶多酚常见的提取方法有:水浸提法[2]、常压溶剂提取法[3-5]、离子沉淀法[6]、真空耦合超声提取法[7]、超高压提取法[8]、超临界CO2流体萃取法[9-10]等。上述方法大都单独考察萃取茶多酚的工艺条件,而采用醇水-超临界CO2流体联合萃取技术获取茶叶中的茶多酚的研究则较少有报道。由于超临界CO2萃取茶多酚存在产品较纯,绿色环保,但得率不高的现象,而溶剂提取法存在提取方法简单,得率较好,但杂质较多等问题,故本文分别比较了超临界CO2流体萃取法,醇水浸提法,醇水-超临界CO2流体联合萃取法提取茶多酚的得率和纯度差异,并初步考察了最优条件下三种提取物的抗DPPH·的效果,以期找到最优的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑茶 湖南城市学院黑茶研究所自制散茶;福林酚试剂 上海荔达生物科技有限公司;没食子酸标准品 纯度>98%,上海江莱生物科技有限公司;无水乙醇、甲醇、无水碳酸钠 均为分析纯；水为二次蒸馏水。

HA121-50-02型超临界萃取装置 江苏南通华安超临界萃取有限公司;RE2000A型旋转蒸发仪 上海雅荣生化设备仪器有限公司;U-3010紫外分光光度计 日本岛津公司;SF-130型粉碎机 湖南中诚制药机械厂;FD-1PF真空冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司;PC-104型万分之一分析天平 上海精密仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的预处理 茶叶样品根据GB/T 8303-2003[11]中的茶叶磨碎方法,先用粉碎机将茶叶粉碎并过60目筛,然后按GB/T 8304-2003[12]中的120℃烘干法对茶样进行烘干。

1.2.2 茶样的提取方法 方法1:超临界CO2流体萃取法(SFC)。取100g茶粉置于萃取釜,以不同浓度的乙醇作为夹带剂,进行超临界CO2流体萃取,2h后收集分离釜中的提取液。影响茶多酚提取效果的因素很多,根据相关文献[9-10]提及的单因素实验及预实验确定因素范围。采用正交实验法优化超临界CO2的萃取条件,正交实验方案设计如表1所示。

表1 超临界CO2流体萃取正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels for SFC extraction method

方法2:醇水浸提法。取1g茶粉,在溶剂中先超声30min,根据相关文献[3-5]提及的单因素实验及预实验确定因素范围。采用正交实验法优化溶剂浸提条件,见表2,然后合并浸提液。

方法3:醇水浸提-超临界CO2流体联合萃取法。由于CO2为非极性物质,茶多酚在超临界CO2流体中的溶解度较低,直接浸提的茶多酚得率较低,故取方法2中的最优溶剂浸提条件先进行溶剂法提取茶叶中的茶多酚,在不加夹带剂情况下进行超临界CO2流体提取,将茶汤中的茶多酚进行提纯,并尽量减少茶多酚的损失。实验条件如表3所示。

表2 醇水浸提正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels for solvent extraction method

表3 联合浸提正交实验因素水平表Table 3 Factors and levels for solvent-SFC co-extraction method

1.2.3 茶多酚的得率及产品纯度测定及计算方法 各提取液经0.45μm滤膜过滤→滤液旋蒸去溶剂→用水溶解定容→产品真空冷冻干燥→产品干粉→取部分干粉→用水溶解定容→乙酸乙酯萃取→酯相经柠檬酸水溶液洗涤→减压浓缩回收乙酸乙酯→用水溶解定容,以没食子酸为标准品,用紫外分光光度法测产品中茶多酚(GB/T 8313-2008[13])的总含量。计算茶多酚的得率(%)=茶多酚质量/茶样质量×100。产品干粉中茶多酚纯度计算方法:纯度(%)=茶多酚质量/产品干粉质量×100。

1.2.4 茶叶浸提物对DPPH·的清除作用 将三种提取方法得到的产品干粉取部分样品用无水乙醇溶解稀释至400μg/mL作为样品溶液,取样品溶液100μL于96孔板上,加入浓度0.2μmol/L的DPPH 100μL作为样品组,以无水乙醇代替溶液作为参比溶液,以无水乙醇代替DPPH溶液作为背景组,以无水乙醇代替样品溶液作阴性对照,以浓度为400μg/mL的维C溶液代替样品溶液作阳性对照组,置30℃培养箱30min,用酶标仪测定每孔517nm吸光值,重复3次实验。以维生素C溶液为阳性对照。提取物对DPPH·的抑制率计算[14]:

清除率(%)=[1-(OD样品/阳性-OD背景)/OD阴性]×100

2 结果与分析

2.1 没食子酸的标准曲线

采用波长扫描确定没食子酸标准品的最大吸收波峰位置(765nm),在最大吸收波长处进行吸光度的测定,得到的标准曲线如图1所示。

图1 没食子酸的标准曲线Fig.1 The standard curve of Gallic acid

没食子酸标准曲线方程为:Y=0.0375+0.0097C,R2=0.9990,说明没食子酸吸光度与浓度呈良好的线性关系。

2.2 茶多酚的谱图分析

图2分别为黑茶样品经联合浸提后的萃取产品经乙酸乙酯纯化后茶多酚(a)及没食子酸标准品(b)的紫外图谱。由图可知,样品中的吸收峰位置和标准品基本一致,未出现杂质峰,说明测试样品具有较好的纯度。

图2 茶样及没食子酸标准品的紫外图谱 Fig.2 The UV spectrums of standard and tea sample

2.3 超临界CO2流体萃取结果分析

由正交实验结果可知,各因素对萃取率的影响的显著性大小为:温度A>压力B>夹带剂用量D>浓度C。最佳萃取条件为:A2B3C1D2,即萃取温度50℃、萃取压力25MPa、夹带剂浓度60%、夹带剂用量1∶20(g∶mL)。重复3次最佳实验条件,茶多酚得率为0.76%±0.03%,产品纯度为:32.59% ±1.72%。和文献[9]相比,该得率偏低,分析原因是:文献[9]的超临界萃取对象是绿茶,本论文体系是黑茶,黑茶经过发酵后茶多酚被部分氧化,含量降低;超临界萃取效果受仪器设备的限制,文献采用了美国Foss公司设备,仪器承受压力和精密性均强于本文中的设备。

2.4 醇水浸提结果分析

由表5可知,各因素对茶多酚提取率影响大小依次为:乙醇浓度C>浸提时间B>料液比D>浸提温度A。茶多酚提取率最佳的工艺条件为:A2B3C3D1,即浸提温度60℃,浸提时间2.0h,乙醇浓度80%,料液比1∶10g/mL,重复3次最佳实验条件,茶多酚得率为6.25%±0.46%,产品纯度为:21.37%±1.51%。

2.5 醇水-超临界CO2联合浸提结果分析

经2.4中最优条件下提取的茶汤再进行超临界CO2联合浸提。由表6可知,各因素对茶多酚的得率影响不大,对产品纯度的影响较为显著,显著性大小为:温度A>压力B>萃取时间C。最佳萃取条件为:A2B3C2,即萃取温度50℃、萃取压力25MPa、萃取时间2h。重复3次最佳实验条件,茶多酚得率为6.36%±0.81%,产品纯度为:41.22% ±3.19%。茶样醇水提取物经联合浸提后茶多酚的纯度由21.37%提高到了41.22%,说明超临界CO2流体萃取了部分咖啡碱、小分子色素、部分酯类、蛋白等物质。同时,茶多酚的得率变化不大,说明未加携带剂时,茶多酚在超临界CO2流体中的溶解度很小,茶多酚的损失很少。

表4 超临界CO2流体萃取结果分析Table 4 Results of SFC extraction method

表5 醇水浸提结果分析Table 5 Results of solvent extraction method

2.6 茶叶浸提物对DPPH·的清除作用

比较三种不同方法的茶样提取物对DPPH·的清除效果如表7所示,由表7可知:茶叶经联合浸提方法得到的产品干粉对DPPH·具有很好的清除效果。

3 结论

经紫外可见分光光度法获得的没食子酸吸光度和浓度有良好的线性关系。

经SFC法得到的茶多酚产品纯度较好,但得率较低。醇水浸提法得到的产品得率较好,产品纯度偏低,醇水-SFC联合浸提法在最佳提取条件下得到的茶多酚产品纯度较醇水浸提后由21.37%明显提高至41.22%,得率变化不大,说明茶多酚在提纯过程中无损失。相同浓度下,茶汤的香味基本无变化,无苦涩味,颜色稍有变浅。茶汤中的其他成分如咖啡碱、茶褐素、茶黄素等量的变化有待于进一步研究。

表6 醇水-超临界CO2联合浸提结果分析Table 6 Results of solvent-SFC co-extraction method

表7 茶叶提取物对DPPH·的清除效果(n=3)Table 7 The clearing effect of tea extract on the DPPH·(n=3)

醇水-SFC联合浸提的产品呈现较好的去DPPH·效果。该提取物可能进一步开发成黑茶饮品,为黑茶的进一步研究和开发提供一种可能的发展途径。

[1]Nakagawa T,Yokozawa T,Terasawa K,et al. Protective activity of green tea against free radical-and glucose-mediated protein damage[J]. Joumal of Agriculture & Food Chemistry,2002,50(8):2418-2422.

[2]罗亚楠,于晓洋,刘立群.茶叶中茶多酚的提取及分析检测[J].化学世界,2011(9):526-528,533.

[3]段红星,周春娥,李家华.不同溶剂对普洱茶(熟茶)茶多酚提取的影响研究[J].云南农业大学学报:自然科学,2014,29(2):246-250.

[4]刘佳,焦士蓉,唐远谋,等.苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性[J]. 食品科学,2011,32(14):134-138.

[5]浦周芳,韩丽琴,曹宏梅. 茶叶中茶多酚提取及含量测定的研究[J]. 食品研究与开发,2013,34(17):83-85.

[6]何健,印伟.茶叶中茶多酚的提取工艺及其含量测定[J]. 中国药业,2011,20(13):31-32.

[7]付婧,岳田利,袁亚宏,等.真空耦合超声提取茶多酚的工艺研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版,2013,41(3):172-178.

[8]江东文,黄佳佳,杨公明,等.响应面法优化超高压辅助提取茶多酚的工艺研究[J].现代食品科技,2013,29(6):116-1320.

[9]王朝瑾,马红青,陈温娴.超临界萃取茶叶中茶多酚的提取与应用[J].分析科学学报,2009,25(3):281-284.

[10]李文婷,车振明,罗梦莹. 超临界CO2萃取绿茶中茶多酚工艺的研究[J].食品工业,2011(7):22-24.

[11]中华人名共和国国家标准—茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定[S].GB/T 8303-2002.

[12]中华人名共和国国家标准—茶水分测定[S].GB/T 8304-2002.

[13]中华人名共和国国家标准—茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[S].GB/T8313-2008.

[14]WU H C,CHEN H M,SHIAU C Y. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of Mackerel(Scomber austriasicus)[J]. Journal Food and Nutrition Research,2003(36):949-957.

Solvent-SCF co-extraction oftea polyphenols from black tea

YIN Zhi-fang,PENG Xiao-yun,YANG Yu-qiang,XIE Wen,ZHAO Yun-lin*

(Department of Chemistry & Environmental Engineering,Hunan City University,Yiyang 413000,China)

Homemade black tea as research object,Supercritical CO2fluid extraction(SCF),Solvent leaching and SCF-Solvent co-extraction were used to extract tea polyphenols from black tea with orthogonal tests to optimize the extraction technology,then the yields and purities of tea polyphenols in the samples which were calculated after ultraviolet detection at 765nm with gallic acid as standard sample. And the DPPH· clearance rates were studied between the extraction methods. The results showed that the Solvent-SCF co-extraction was the best method. After Solvent leaching(ethanol concentration 80%,solid to liquid 1∶10g/mL,extraction temperature 60℃,extraction time 2h),the solution were extracted with SCF at 25MPa,50℃ for 2h.Under the best conditions for the Solvent-SCF co-extraction method,high yield and high purity of tea polyphenols can be obtained with yield of 6.36% ± 0.81% and purity of 41.22% ± 3.19%.The DPPH· clearance rate of products was 90.64% ± 0.0187%. This method was environmental protection,not adding any harmful solvents,which can provide the reference for the further development of black tea research.

black tea;tea polyphenols;Supercritical CO2;co-extraction

2014-07-24

尹志芳(1978-)，女，硕士，副教授，主要从事新型分离技术研究。

*通讯作者:赵运林(1959-)，男，博士，教授，主要从事生态植物学研究。

黑茶发酵及功能成分提取技术湖南省应用基础研究基地开放课题(2013HCKF02);湖南省教育厅产业化培育项目(11CY004);湖南省普通高校校企合作人才培养示范基地开放基金项目(湘教通〔2012〕434号); 国家级大学生创新创业训练计划项目(201211527007)。

TS205

B

1002-0306(2015)05-0194-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.032