黑豆中大豆异黄酮微波提取工艺的优化

郭 婕,刘中华,袁淑培,王永立,李俐俐

(周口师范学院生命科学与农学学院,河南周口 466000)



黑豆中大豆异黄酮微波提取工艺的优化

郭 婕,刘中华,袁淑培,王永立,李俐俐

(周口师范学院生命科学与农学学院,河南周口 466000)

采用微波提取法,利用单因素和L9(34)正交实验,对黑豆中大豆异黄酮提取率的影响因素及最佳提取工艺进行研究。结果表明,料液比、乙醇浓度、微波功率、微波处理时间对黑豆中大豆异黄酮的提取率均有不同程度的影响,其中微波功率对异黄酮的提取率影响显著(p<0.05)。最佳提取工艺为料液比1∶25(g/mL)、60%乙醇、微波功率为300W、微波处理2min。在最佳提取条件下,黑豆中大豆异黄酮的得率为0.488%±0.01%。该提取工艺稳定可行,可为大豆异黄酮的提取提供参考。

黑豆,大豆异黄酮,微波提取

黑豆系豆科植物中种皮为黑色的大豆,具有悠久的食用和药用历史[1]。《本草纲目拾遗》中记载,长期食用黑豆可以强身健体、滋养肌肤、美容乌发,具有延缓衰老的功效[2]。黑豆除了营养丰富外,同时又具有多种生物活性物质,如黑豆色素、多糖和异黄酮等[3]。大豆异黄酮是大豆等豆科植物生长过程中产生的一类次生代谢产物[4],是大豆中主要的活性物质。异黄酮与人体健康密切相关,具有许多生理功能,如抗氧化、抗癌、预防骨质疏松症、改善更年期综合症等[5-6]。我国先人药用多选黑豆,这可能与异黄酮类含量有关[7]。

微波辐射容易破坏细胞,从而使异黄酮在短时间内从细胞内溶出[8]。微波辅助提取法与常规溶剂浸提法相比,具有省时、节约溶剂、产品纯度及提取率高[9]等优势,且提取的有效成分没有明显区别。目前,微波辅助法已应用于中药、豆科植物及豆类产品副产物中异黄酮的提取,如葛渣[10]、槐角[11]、豆渣[12]等,但利用微波辅助法对黑豆中大豆异黄酮提取工艺的研究鲜有报道。故本实验利用微波辅助法提取黑豆中的大豆异黄酮,以异黄酮含量为指标,在料液比、乙醇浓度、微波功率、微波处理时间四个单因素实验的基础上,通过正交实验确定黑豆中异黄酮的最佳提取条件。我国黑豆资源丰富,以黑豆为原料,开发利用大豆异黄酮及相关产品具有便利的条件。以期为黑豆中大豆异黄酮的工业化提取提供参考,也为进一步研究其生物学活性及在保健食品中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑豆 产自河南省周口市巴集乡。染料木素 上海金穗生物科技有限公司 HPLC≥98%;无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂 分析纯;正己烷 天津市富宇精细化工有限公司 分析纯;次氯酸钠 武汉华威化工仪器有限公司 分析纯。

UV-5100型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;实验室微波炉 南京杰全微波设备有限公司;AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;高速万能粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑豆中大豆异黄酮提取工艺流程 黑豆干燥至恒重,粉碎,过40目筛,称重→按照料液比1∶3加入正己烷,脱脂2次[13]→低温干燥,粉碎,过40目筛→准确称取2g→加入乙醇,室温浸泡0.5h,微波提取2次→抽滤→合并提取液→加乙醇溶液定容至100mL→260nm处测吸光度。

1.2.2 大豆异黄酮标准曲线的绘制 分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL浓度为40μg/mL的染料木素标准溶液,置于各试管中,加70%乙醇定容至10mL,摇匀,以70%乙醇调零,在260nm处测定吸光度[14]。以待测试管中染料木素的浓度(μg/mL)为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,并作回归处理,得回归方程y=0.1166x-0.0015,R2=0.9998。

1.2.3 黑豆中大豆异黄酮提取率的测定 从稀释的样品提取液中各取1mL,置于10mL的试管中,依照上述方法处理,于波长260nm处测定吸光度。按照以下公式计算黑豆豆芽异黄酮的得率(%)。

大豆异黄酮的得率(%)=cVK×10-4/W

式中:c为测量液中异黄酮的浓度(μg/mL);V为提取液的体积(mL);K为提取液稀释的倍数;W为原料的干重(g)。

1.2.4 单因素实验 对预处理过的黑豆粉,利用微波提取法,以异黄酮含量为指标,经单因素实验初步考察料液比、乙醇浓度、微波功率、微波处理时间四个因素对黑豆中大豆异黄酮得率的影响。

以70%乙醇为提取剂,分别设置料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL),微波功率为450W,微波处理2min,研究料液比对黑豆中大豆异黄酮得率的影响。

分别以浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇做提取剂,料液比1∶20(g/mL),微波功率为450W,微波处理2min,研究乙醇浓度对黑豆中大豆异黄酮得率的影响。

以60%乙醇为提取剂,料液比1∶20(g/mL),微波处理2min,研究不同微波功率150、300、450、600、750W对黑豆中大豆异黄酮得率的影响。

以60%乙醇为提取剂,料液比1∶20(g/mL),微波功率为300W,分别微波处理0.5、1、2、3、4、5min,研究不同微波时间对黑豆中大豆异黄酮得率的影响。

1.2.5 正交实验优化 在单因素实验的基础上采用L9(34)正交表对以上四个因素进行正交实验进一步优化,确定黑豆中大豆异黄酮的最佳提取条件。因素水平安排见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 数据处理

利用Excel 2003和正交设计助手进行数据分析及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比的初步筛选 由图1可知,当料液比为1∶20时,黑豆中大豆异黄酮得率最高,为0.217%±0.009%;随着料液比的增加或减少,异黄酮得率均有降低趋势。在一定范围内,提取溶剂较多时,提取液中大豆异黄酮的浓度低,增大了大豆异黄酮在固液相中的浓度差[15],有利于大豆异黄酮扩散至提取剂中。而料液比继续增加,溶剂对微波能量的吸收增加,细胞对微波能量的吸收减少,细胞壁破裂程度相对减少,大豆异黄酮从细胞中溶出量减少[16]。且提取剂过多,导致其他杂质过多溶出,影响异黄酮溶解[17]。初步确定料液比为1∶20(g/mL)。

图1 料液比对黑豆中大豆异黄酮得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of soybean isoflavones

2.1.2 乙醇浓度的初步筛选 由结果图2可知,乙醇浓度较小时,随着乙醇浓度的提高,黑豆中大豆异黄酮得率增大,在60%达到最高为0.279%±0.008%;随着乙醇浓度继续提高,异黄酮得率开始降低。其原因是乙醇浓度过低,导致醇提不能充分进行,使得得率降低。乙醇浓度过高或者过低都与异黄酮的极性不一致[18],对异黄酮的提取均有抑制作用。初步选择乙醇浓度为60%。

图2 乙醇浓度对黑豆中大豆异黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of soybean isoflavones

2.1.3 微波功率的初步筛选 由结果图3可知,微波功率为300W时,黑豆豆芽中大豆异黄酮得率最高,为0.322%±0.009%。功率低于或高于300W时,异黄酮得率均稍低。主要原因是在一定范围内,随着微波功率的增大,细胞壁破裂程度加大,异黄酮浸出量随之升高[19]。但微波功率过高时,溶剂分子的剧烈运动占主导地位,溶液中的蛋白质变性,进而对黑豆中的异黄酮分子产生不可逆束缚作用,阻碍异黄酮分子的浸出[20]。故初步选择微波功率为300W。

图3 微波功率对黑豆中大豆异黄酮得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on the extraction yield of soybean isoflavones

2.1.4 微波处理时间的初步筛选 由结果图4可知,随着微波处理时间从0.5min增至5min,黑豆中大豆异黄酮得率逐渐增大后有所下降,在3min时,得率达到最高为0.389%±0.007%。其原因是微波处理时,在一定范围内,提取时间的延长有助于黑豆粉颗粒的溶胀及异黄酮的溶出,使提取率提高[21]。但微波时间过长,温度升高,异黄酮不稳定易分解,使提取率降低[22]。初步选择微波处理时间为3min。

图4 微波处理时间对黑豆中大豆异黄酮得率的影响Fig.4 Effect of microwave-heating time on the extraction yield of soybean isoflavones

2.2 正交实验优化结果

为确定黑豆中大豆异黄酮的最佳提取条件,根据前述实验所确定的单因素条件,选取四因素三水平进行正交实验进一步优化,所得正交实验结果如表2。

表2 正交实验结果Table 2 The results of orthogonal test

表3 提取率方差分析Table 3 Variance analysis of the extraction yield

通过正交实验结果表2极差分析可知,影响黑豆中大豆异黄酮提取率的几个因素顺序为:微波功率>料液比>微波处理时间>乙醇浓度。方差分析表3显示微波功率对黑豆豆芽中大豆异黄酮的得率影响表现显著(p<0.05)。综合极差和方差分析得出最佳组合为A3B2C2D1,即黑豆中大豆异黄酮的最佳提取条件:料液比1∶25(g/mL)、60%乙醇、微波功率为300W、微波处理2min。按照最佳提取条件重复三次,进行验证性实验,所得黑豆中大豆异黄酮的得率分别为0.495%、0.476%、0.492%。故最佳提取条件下,黑豆中大豆异黄酮得率为0.488%±0.01%。

3 结论

以大豆异黄酮为指标,利用紫外分光光度法测定黑豆豆芽中大豆异黄酮的含量。通过单因素及L9(34)正交实验,分析料液比、乙醇浓度、微波功率和微波处理时间对黑豆豆芽中大豆异黄酮得率的影响,并优化最佳提取条件。经分析可知,影响异黄酮提取率的几个因素主次顺序为:微波功率>料液比>微波处理时间>乙醇浓度,其中微波功率对异黄酮的提取率影响表现显著(p<0.05)。黑豆中大豆异黄酮的最佳提取条件:料液比1∶25(g/mL)、60%乙醇、微波功率为300W、微波处理2min。经验证,此条件下黑豆中大豆异黄酮提取率为0.488%±0.01%。

微波辅助法提取黑豆中大豆异黄酮操作简便、可行,且产品提取率高,可以为进一步研究黑豆中大豆异黄酮的分离、纯化,及其在食品、医药方面的应用提供参考。

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Optimization of microwave-assisted extraction technologyof soybean isoflavones from black soybean

GUO Jie,LIU Zhong-hua,YUAN Shu-pei,WANG Yong-li,LI Li-li

(College of Life Science and Agronomy,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466000,China)

Microwave-assisted extraction was used to extract soybean isoflavones from black soybean. The influence factors of impacting extraction yield and the optimal extraction conditions were studied by single factor and L9(34)orthogonal experiment. The results showed that all the factors including solid-liquid ratio,ethanol concentration,microwave power and microwave-heating time had different effects on the yield of soybean isoflavones. And the effect of microwave power was significant(p<0.05). The optimal conditions were as follows:the 1∶25(g/mL)ratio of solid-liquid,60% ethanol,microwave power was 300W,extracting for 2min. The yield of soybean isoflavones was up to 0.488%±0.01% under these conditions. The method was stable and feasible,which could be applied for the extraction of soybean isoflavones.

black soybean;soybean isoflavones;microwave-assisted extraction

2014-07-09

郭婕(1984-),女,硕士,讲师,研究方向:天然药物化学。

周口师范学院大学生科研创新基金项目(ZKNUDXS2014-021);河南省教育厅自然科学基础研究计划项目(2010B180032)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)05-0255-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.045