纤维素酶的制备工艺及其商业化现状研究

闫玉玲, 袁敬纬, 李 杰, 张 宏

纤维素酶的制备工艺及其商业化现状研究

闫玉玲1, 袁敬纬2, 李 杰2, 张 宏3

（1. 辽宁石油化工大学，辽宁 抚顺113001； 2. 中粮生化能源（肇东）有限公司，黑龙江 肇东 151100；3. 中国石油辽河油田公司研究院，辽宁 盘锦 124010）

综述了纤维素酶制备技术如固体发酵、液体深层发酵、固-液交替新型发酵、固定化细胞技术、混菌发酵等方法。对各种工艺的流程、影响因素及优缺点等进行了论述，并对纤维素酶制备的发展趋势进行了探讨；最后对纤维素酶的商业化生产现状和主要的生产商进行了介绍。

纤维素酶；制备；固体发酵；液体发酵；固定化；混菌发酵；商业化

近年来纤维素乙醇获得了较快发展，但距离大规模商业化运行还有一定的距离。其中制约其大规模商业化的主要原因之一是纤维素酶成本过高[1]。以产值计算，商业化纤维素酶制剂是全球第三大工业酶制剂。目前主要用于纺织、造纸、食品、饲料等行业。纤维素酶最大的工业需求领域将在纤维素乙醇制备方面，如果应用酶解技术生产乙醇、丁醇等生物燃料，那么纤维素酶将成为需求量最大的工业用酶[2]。发达国家如美、日等对纤维素酶的应用几乎渗透到一切以植物为原料的加工业。同时，纤维素酶在废水处理、环境保护以及基因、遗传和细胞工程等各个生产领域也有大量的应用。随着现代生物技术的发展，纤维素酶制备工业进入到高速发展阶段，制备技术将提高到一个新的水平。

1 纤维素酶的制备工艺

1.1 固体发酵生产纤维素酶

固体发酵法(SSF)是指1种或多种微生物在没有或几乎没有游离水的固态湿培养基上的生长过程和生物反应过程。固体发酵法又称麸曲培养法。主要原料一般是麸皮、米糠等。农作物秸秆、甘薯渣、玉米粉、豆粕、压扁谷粒等通常也可以作为主要原料或辅助原料。

固态发酵生产纤维素酶工艺流程图如1所示。首先对发酵原料灭菌，然后将菌种接入到与适当的水充分混合的培养基中，选择适宜的温度和湿度进行发酵，最后用缓冲溶液（或无菌水）抽提纤维素酶，即可得到粗酶液。

固体发酵法具有以下优点[3]:①发酵条件接近于自然状态下的真菌生长习性，产酶量一般比液体发酵法高出2～3倍，产生的酶系更全，有利于降解天然纤维素，固体纤维素酶曲可直接用于纤维素糖化。②次级代谢产物对菌体的分裂增值影响较小。③能耗低，发酵过程需要通入少量低压无菌的空气，不需搅拌。④固体发酵对水活度要求较低，发酵过程中可一定程度上避免外源性污染。⑤所用原料比较简单，后处理设备少，生产成本低。

固体发酵法也存在缺陷：因为采用天然原料，易污染杂菌，生产的纤维素酶杂质含量高，因而精制困难。而且所产生的酶质量不稳定，生产效率较低。因此，不能像液体发酵那样大规模地扩大。

影响固态发酵的因素很多，如水分、培养基组分、发酵温度、发酵时间以及固态基质的需氧量等。通常固态培养基中自由水含量很少，但是其中必须含有适量的水分，以吸附水的形式存在。除了水分外，培养基营养组分也很重要，因为不同的菌株对各种营养物质的需求不同；发酵温度和发酵时间也是影响纤维素酶活的重要因素，例如除个别嗜热菌体固体发酵制备纤维素酶时的发酵温度较高外，纤维素酶生产的最适宜温度通常都在 28～30 ℃；发酵体系中充分的通气量可以保证纤维素酶生长所需的充足的氧气量。

1.2 液体深层发酵生产纤维素酶

液体发酵法(SP)是指将微生物接种到液体培养基中进行培养的方法。液体发酵法分为液体表层发酵法和液体深层发酵法。由于液体表层发酵法已基本被淘汰，本文主要讨论液体深层发酵法。

纤维素酶液态发酵通常是将秸秆粉、玉米芯、麸皮等原材料经粉碎等预处理后进行高压蒸汽灭菌，然后送至发酵罐内，同时接入纤维素酶菌种，从罐底部通入无菌空气进行物料的气流搅拌，发酵过程控制适宜的温度、pH值等发酵条件，其工艺流程如图2所示。

液体深层发酵技术具有自动化程度高、包容性及发酵容量大等优点，西方发达国家己逐步用该技术取代固体发酵技术来生产各种抗生素及酶制剂,目前国内外大都在探索液体发酵生产纤维素酶。但液体发酵法也存在动力消耗大、设备要求高、生产成本高等缺点。

培养基组分、发酵温度、发酵液pH值、通风搅拌量等是影响液体发酵产酶的主要因素。其中培养基组分是关键，合适的营养源（包括碳源、氮源无机盐和其他微量元素）配比是发酵产酶的基础。为了降低成本，纤维素酶生产的碳源和氮源可以采用廉价废弃物，这方面的研究工作由于具有明显的实用性而越来越受到人们的青睐。发酵温度和 pH值的变化可以引起微生物代谢途径发生变化，对细胞内各种酶的活性有较大影响。通风搅拌量决定了发酵液中溶氧量的大小及微生物细胞与营养底物的接触情况。除此之外，由于真菌纤维素酶是胞外酶，具有可诱导性，因此发酵中可以添加诱导剂和表面活性剂来提高产酶量[4]。

1.3 其他发酵工艺

1.3.1 固-液交替新型发酵工艺

如前所述，液体发酵较之固体发酵具有更多优点，因此工业上较多采用了液体发酵来大规模生产纤维素酶，但液体发酵之培养周期长和废水难处理等问题，制约了纤维素酶的生产。如果能将两种发酵模式结合起来，充分发挥二者的优点，会给传统的发酵工艺带来革新，从而提高纤维素酶活性及产率。目前在纤维素酶生产中使用的生物床及固定化细胞等技术，就是有效地将固体发酵与液体发酵相融合的典范，综合两者的优点，更适于规模化生产。

1.3.2 固定化细胞技术

固定化细胞技术是利用物理或化学手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性，以达到反复利用的目的。

固定化细胞与游离细胞相比，具有能使发酵罐内细胞浓度提高、遗传性质稳定、细胞可重复或连续使用等特点[5]。同时，固定化技术具有减少对细胞的剪切伤害，提高产物的制备效率，提高产品收率，方便产物回收，同时可降低产物的生产成本，实现连续化生产等优点。 目前，因为结合了固体发酵与液体发酵的优点，固定化细胞技术己被广泛应用于纤维素酶生产中，该技术能在一定程度上解决维素酶制备中遇到的问题，提高纤维素酶产品的性能。

目前固定化细胞载体主要有3大类：第1种是无机载体，如活性炭、多孔陶珠、红砖碎粒、沙粒、微孔玻璃、高岭土、硅藻土等。第2种是有机高分子载体，又分为天然高分子材料（如琼脂、角叉莱胶、明胶、海藻酸钠等）和有机合成高分子凝胶载体（如聚乙烯醇(PVA)凝胶、聚丙烯酰胺(ACRM)凝胶等），其中前一种无生物毒性、传质性好，但强度低，在厌氧条件下易被生物分解，而后一种强度较好，但传质性能较差。第3种是复合载体，由有机载体材料和无机载体材料结合而成，复合载体可实现有机和无机两类载体材料在许多性能上的优势互补。

应用于微生物细胞固定化的方法主要有包埋法、吸附法、交联法和截留法，其中前两种方法最为常见。

1.3.3 混菌发酵

混菌发酵也称共发酵，一般指采用2种或2种以上微生物协同作用共同完成发酵过程的发酵技术，是纯种发酵技术的新发展。该技术操作简单，且可以提高发酵效率甚至形成新产品，从而取得与复杂DNA体外重组技术类似的效果。进行混菌发酵时，由于不同菌种产生的纤维素酶系不同，产生多种不同功能的酶将作用于纤维素的不同位点，这就可以弥补菌种之间的差异，将各酶系之间的协同作用发挥最大化，从而最大限度提高纤维素酶的活性及产量。除了可以对酶的各组分进行补充优化，混菌发酵还能减弱一些发酵过程中的抑制作用。

木霉菌与曲霉菌混菌发酵可以得到较优的纤维素酶产品，木霉和青霉混合发酵也可使纤维素酶活性大幅度提高。这已经成为该领域许多研究工作者较常采用的共发酵策略。例如，里氏木霉所产的纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶活性低，为了克服这一缺点，Kumar R等[6]利用黑曲霉和里氏木霉1:3混菌发酵，研究结果表明混合发酵后内切葡萄糖苷酶活性和外切葡萄糖苷酶活性都能提高31%～35%，同时β-葡萄糖苷酶活性提高40%；Ahamed A等[7]用黑曲霉LMA和里氏木霉RUT-C30混合发酵，结果表明滤纸酶活达到了 7.1 U/mL,较单菌发酵的提高了 108.8%；张继泉等[8]在黑曲霉和烟曲霉固态发酵中接入少量假丝酵母混合培养，研究其对纤维素酶活性的影响。结果发现混菌发酵后黑曲霉和烟曲霉纤维素酶系中滤纸酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶及淀粉酶的活性均有明显提高。然而，不是任意的菌株都能用来混菌发酵产纤维素酶，菌种搭配时要注意菌株之间的相容性[9]。

2 纤维素酶制备工艺的发展趋势

运用各种科学方法提高纤维素酶的活力和产量已成为酶解工程的重要课题。先进的纤维素酶生产工艺，将为纤维质原料在新能源领域的应用提供广阔的平台。

目前，采用液体深层发酵方式制备纤维素酶是大部分商业酶制剂公司的首选。这在一定程度上体现了该技术在生产木质纤维素酶产品方面的综合经济优势。但它也存在诸多缺点。开发符合纤维素乙醇工程化要求的液体发酵新技术，是优化纤维素酶发酵工艺的途径之一。采用新型发酵工艺如固定化细胞发酵、混菌发酵等将是纤维素酶制备方法的发展趋势。固定化细胞发酵产酶技术不但有利于提高纤维素酶的产率，而且可以实现其连续化生产，其中细胞固定化材料的选择和固定化方法的确立是关键。混合菌发酵产酶技术可以产生多种不同功能的酶并且作用于纤维素的不同位点, 充分发挥各酶之间的协同作用，从而提高酶的活性，并弥补菌种之间的差异。大量研究己聚焦于固定化细胞发酵和混菌发酵制备工艺上，以期获得优质的木质纤维素酶产品。这些年，这几种新型发酵技术研究已取得了可喜的实验室成果，但很多工作尚处于探索阶段，今后有待深入探索，力争在工业上应用。

3 纤维素酶的商业化生产

20 世纪 90 年代，每加仑纤维素乙醇的酶成本约为 5美元。为了降低酶费用，许多大的酶制剂公司纷纷研究开发高效、低成本的纤维素水解酶。2011年杰能科公司（Genencor）在Accellerse DUET 基础上推出新一代的纤维素复合酶Accellerase® TRIO产品[10]，该产品可用于SSCF 发酵工艺，具有处理高浓度底物能力强，酶用量减半的优势。

2012 年诺维信公司（Novozymes）在其上一代商业酶 CTec2的基础上推出酶制剂产品 Cellic CTec3[11]，该产品较上一代产品在温度和酸碱度的适应范围上大有提高，转化效率较上一代提高了50%；丹麦DSM 公司也推出了商业应用的纤维素水解酶，为Inbicon 纤维素乙醇生产装置提供水解用酶。表1列出了商业化生物炼制纤维素酶生产商代表产品主要信息。国际上几家大的酶制剂公司概况见表1。

［1］ 张宇，许敬亮，袁振宏，等.世界纤维素燃料乙醇产业化进展[J].当代化工，2014，43（2）：198-202；206.

［2］ Wilson D B. Cellulases and biofuels [J]. Curr Opin Biotechnol, 2009, 20(3): 295-299.

［3］ Singhania R R, Patel A k, Soccol C R, Pandey A. Recent advances in solid-state fermentation[J]. Biochem. Eng.J., 2009,44:13-18.

［4］ 杨涛.水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究[D].长沙：湖南农业大学，2008.

［5］ 景春娥，赵旭，常思静，等.纤维素酶在燃料乙醇工业中的应用研究进展[J]. 酿酒科技，2009（3）：98-102.

［6］ Kumar R, Singh R P. Semi- solid- state fermentation of Eic-chornia crassipes biomass as lignocellulosic biopolymer forcellulase and β -glucosidase production by cocultivation of Aspergillus niger RK3 and Trichoderma reesei MTCC164[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2001,96(1-3):71-82．

［7］hamed A, Vermette P. Enhanced enzyme production from mixed cultures of Trichoderma reesei RUT-C30 and Aspergillus niger LMA grown as fed batch in a stirred tank bio-reactor[J].Biochemical Engineering Journal,2008,42(1):41-46.

［8］张继泉,王瑞明,孙玉英,等.里氏木霉生产纤维素酶的研究进展[J].饲料工业, 2003, 24(1):9-13.

［9］Wilson D B. Cellulases and biofuels [J]. Curr Opin Biotechnol, 2009, 20(3): 295-299.

［10］Genencor. ACCELLERASETRIO optimized cellulase ，hemicel lulase and beta -glucosidase enzyme complex for improved lig nocellulosic biomass hydrolysis[R/OL].US：Genencor，2012. htt p：//www. genencor. cn /fileadmin/user_upload/genencor/docume nts/ TRIO_ProductSheet _LowRes. pdf.．

［11］Novozymes. Cellulosic ethanol Novozymes cellic CTec3[R/OL].De nmark：Novozymes，2012.http：//www.bioenergy.novozymes. com /en/cellulosic-ethanol/Cellic-HTec3/Documents/CE_APP_Cellic_ Ctec3.pdf.

［12］Anuj K C,Chandrasekhar G,Messias B S,et al.The realm of cell ulases in biorefinery development[J].Critical Reviews in Biotech nology,2012,32(3) :187-202.(TRIO_ProductSheet _LowRes. Pdf)

Preparation Processes of Cellulase and Their Commercialization

YAN Yu-ling1，YUAN Jing-wei2,LI Jie2,ZHANG Hong3
(1. Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 13001, China；2. COFCO Biochemical Energy(Zhaodong)Co.,Ltd.,Heilongjiang Zhaodong 151100, China; 3. Research Institute of Exploration and Development,PetroChina Liaohe Oilfield Company,Liaoning Panjin 124010, China)

The preparation processes of cellulose were summarized, such as solid fermentation, liquid fermentation, solid-liquid alternate new fermentation, the immobilized cell technology and mixed fermentation. And technological process flows, influence factors, advantages and disadvantages of each process were discussed. And development trend of the cellulose preparation process was analyzed. At last, commercial production status and main producers of cellulose were introduced.

Cellulase；Preparation；Solid fermentation；Liquid fermentation; Immobilization；Mixed fermentation；Commercialization

TQ 214

： A

： 1671-0460（2015）05-0988-03

2015-04-14

闫玉玲（1980-），女，甘肃张掖人，编辑，硕士，2009年毕业于辽宁石油化工大学生物化工专业，从事纤维素酶制备研究及科技编辑工作。E-mail：yulingyan1981@126.com。