海雀稗对镉胁迫的生理响应及积累特性

吴朝波， 郭建春， 符少萍， 刘 娇， 李瑞梅， 王 蕾，3， 段瑞军

(1.中国热带农业科学院/热带生物技术研究所，海南 海口 571101;2.海南大学农学院，海南 海口 571101;3.海南大学园林园艺学院，海南 海口 570228)

中国受重金属污染威胁的耕地面积约2×107hm2［1］，2014年由环保部和国土资源部联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示全国镉(Cd)污染超标率达7%［2］。镉毒性强，毒性持久，会对植物造成伤害。在镉胁迫下植物主要表现出叶茎黄化，叶片脱落，株高、叶长、叶宽、茎粗、根长等减少，过高的镉浓度使植物生长停滞，甚至出现枯死。在重金属胁迫下，植物体内会产生大量的活性氧(O·-2)，使细胞膜脂过氧化加强，破坏膜的结构和功能［3］。抗氧化系统是植物体内镉伤害的主要解毒机制［4-5］，由超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等构成植物体内的主要活性氧清除系统［6-7］，清除植物体内过多的活性氧(O·-2)。郑爱珍等［8］研究结果表明，白菜在镉处理下增加了植物叶片SOD、CAT的活性，有利于对活性氧的清除，因而增加了白菜对镉的耐性;彭艳［9］研究铝对小麦保护酶活性的影响，指出一定范围内保护酶活性随镉胁迫强度的增加而上升，SOD、POD、CAT活性的增强是维持小麦耐铝胁迫的重要生理基础;李丽峰等［10］研究镉胁迫对芦苇叶片SOD、POD活性影响的结果表明，当镉处理浓度＜2 mg/kg时，SOD、POD活性随镉浓度增加而升高，能有效调节芦苇体内的活性氧平衡，此浓度内镉胁迫对芦苇的生长影响不大。海雀稗(Paspalum vaginatum Sw.)是一种可以用于草坪、饲料及盐碱地改良的多用途草种［11］，有研究结果表明海雀稗可用于重金属(铅、锌)污染土壤的植物修复［12-15］。本研究以海雀稗为材料，研究其在镉胁迫下的生长、膜质损伤、抗氧化酶活性及其对镉的富集特征，旨在为应用海雀稗修复重金属镉污染土壤提供理论依据，为土壤镉污染植物修复技术的植物筛选提供参考依据［15］。

1 材料与方法

1.1 材料

海雀稗，采自海南岛文昌滨海滩涂。主要试剂: CdCl2·2.5H2O(分析纯)、α-萘胺、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、甲硫氨酸(Met)、氮蓝四唑(NBT)、EDTA-Na2、核黄素等，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;主要仪器:电导率仪(DDS-11A型)、紫外可见光分光光度计(岛津UV-2501PC型);培养基质(土∶沙∶有机质=1∶1∶1，体积比)。

1.2 方法

1.2.1 试验材料处理 本研究于中国热带农业科学院热带生物技术研究所内进行，设置6个镉浓度，3次重复。将15 kg培养基质放入泡沫箱，分别用0 mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、5×10-4mol/L、1×10-3mol/L、2×10-3mol/L CdCl2·2.5H2O水溶液12 L进行处理，充分搅拌混匀，使每箱土壤中的镉浓度分别达到0 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，静置7 d，将海雀稗截取相同的茎段，每个茎段含2个节间，3个芽点，种植于处理好的土壤中，每箱12株，70 d后，测定其形态、生理指标。

1.2.2 形态指标测量 用直尺测量不同处理下的海雀稗株高(cm)、根长(cm);用精度为1/1000电子天平测定海雀稗根、茎、叶鲜质量(g)，3次重复。

1.2.3 叶绿素含量测定 叶绿素含量测定使用紫外分光光度法。称取0.1 g鲜叶，剪成1 mm宽的细条，放入试管中，加10 ml提取液(乙醇∶丙酮=1∶1)，密封，在黑暗条件下浸提24 h(至叶片脱色变白)。分别在663 nm、645 nm、440 nm下比色测定吸光值，3次重复。

1.2.4 根系活力测定 参照张宪政等［16］的方法，将待测根系吸干附着水后称取1 g，加入40 mg/L的α-萘胺溶液和磷酸缓冲液各25 ml，静置10 min后，吸取2 ml溶液，其余在25℃震荡3 h后再吸取2 ml溶液，在2次所吸取的测定液中各加入10 ml蒸馏水，1 ml 1%对氨基苯磺酸和1 ml 100 mg/L亚硝酸钠，静置显色5 min，再加入11 ml蒸馏水，混匀，测定510 nm波长下的吸光值，试验以不加根系的样品作为空白对照，3次重复。

1.2.5 丙二醛(MDA)含量测定 参照郑炳松［17］的方法测定MDA含量，将待测根、茎、叶吸干附着水后各称取0.5 g，加10ml 10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨至匀浆，匀浆离心(2 000 g，15 min)，取上清液2 ml，加0.6%硫代巴比妥酸(TBA) 2 ml，于沸水浴反应15 min，迅速冷却后离心(3 000 g，15 min)。取上清液测定532 nm、600 nm和450 nm波长的吸光度值，3次重复。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 参照李和生等［18］、郝建军等［19］的方法测定SOD活性，将待测根、茎、叶的水分吸干后各称取0.5 g，液氮冰浴研磨，加入5 ml 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)，12 000 r/min冷冻离心20 min，获得酶粗提液，进行SOD活性测定，反应体系见表1，空白置于暗处，对照管与样品管置于4 000 lx荧光灯下显色反应20 min，以空白调零，测定569 nm波长的吸光值，各3个重复。

表1 SOD活性测定反应体系Table 1 The reaction system for SOD activity determination

1.2.7 过氧化氢酶(CAT)活性测定 采用彭志英等［20］的方法测定CAT活性，酶粗提液制备与SOD酶粗提液制备方法相同，取0.1 ml酶粗提液，加入2.5 ml反应液(0.1 mol/L的H2O2与0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液按体积比为1∶4混合)，于240 nm下比色，每隔1 min读数1次，共读3次，3次重复。

1.2.8 叶片细胞膜透性测定 参照刘宁等［21］、陈建勋等［22］的方法测定质膜相对透性，称取0.1 g叶片，用无离子水洗净，剪碎加入10 ml无离子水，自然浸泡6 h，用DDS-11A型电导率仪测定溶液的电导率EC1，沸水浴10 min，冷却后测定电导率EC2，无离子水电导率值为 EC0，质膜透性 =(EC1-EC0)/(EC2-EC0)×100%。

1.2.9 镉含量测定 将镉处理的海雀稗取出，用去离子水冲洗干净，清除表面水分，于105℃下杀青20 min，然后在80℃下烘干至恒质量，称取样品0.5 g，置于100 ml聚四氟乙烯材料的微波消解罐中，加入4 ml硝酸(北化65%BV-III微电子级)和2 ml双氧水(北化30%BV-III微电子级)，盖好密封，按照预设的微波消解条件进行消化处理，将消解后的溶液移至石英试管中，在天平上定质量至20 g，摇匀待测，利用美国生产的安捷伦ICP-MS7500ce电感耦合等离子体质谱仪测定镉含量。

1.2.10 数据分析 试验数据用Excel 2003整理、绘制图标;用SPSS13.0进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 镉胁迫对海雀稗生长的影响

为了研究镉胁迫对海雀稗生长的影响，本研究测定了不同镉浓度胁迫下海雀稗的形态指标(株高、根长、茎叶鲜质量、根鲜质量)。结果(表2)发现:镉浓度0～50 mg/kg时，各性状指标下降不显著;镉浓度为100 mg/kg时，株高、根长未受到显著抑制，根鲜质量、茎叶鲜质量和分枝数较对照显著降低，相对于对照分别下降了28.76%、46.62%、63.57%;当镉浓度为200 mg/kg时，各项生长指标显著下降，海雀稗生长受显著抑制，但仍能完成生活史。通过分析可知，分枝数与根鲜质量、茎叶鲜质量存在极显著相关性，相关系数分别为0.963＊＊和0.977＊＊，分枝数的减少在一定程度上严重影响海雀稗生物量。

表2 镉胁迫对海雀稗生长的影响Table 2 Effect of Cd stress on biomass of Paspalum vaginatum Sw.

2.2 镉胁迫对海雀稗膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量的影响

丙二醛(MDA)作为生物膜氧化的产物，其含量的高低代表植物受逆境胁迫伤害程度的大小。根中MDA积累量随镉处理浓度的增加而上升，当镉浓度≤1 mg/kg时海雀稗根中MDA积累量未显著增加;当镉浓度≥10 mg/kg时海雀稗根中MDA积累量随镉浓度的增加显著升高;当镉浓度达200 mg/kg时，海雀稗根中MDA积累量为对照的29.51倍。当镉浓度≤50 mg/kg时茎中MDA未显著积累;当镉浓度达到100 mg/kg时海雀稗茎中MDA含量显著增加;在海雀稗茎中，当镉浓度增加到200 mg/kg，MDA积累量是对照的4.52倍。海雀稗叶片MDA积累量在镉浓度≤10 mg/kg时无显著变化;当镉浓度为50 mg/kg时，MDA在海雀稗叶片迅速积累;当镉浓度达到200 mg/kg时，海雀稗叶片中MDA积累量达到最大，是对照的1.59倍(图1)。

图1 镉胁迫下海雀稗根、茎、叶中丙二醛(MDA)含量的变化Fig.1 Effect of Cd stress on MDA content in the roots，stems and leaves of P.vaginatum Sw.

2.3 镉胁迫对海雀稗叶片细胞膜透性的影响

细胞膜透性是评价植物对污染物反应的指标之一，对细胞内外物质的交换运输具有调节作用。重金属离子与胞膜相结合，会改变膜蛋白的磷脂结构，细胞膜系统受到破坏，细胞内可溶物外渗，进而电导率增加。海雀稗叶片电导率检测结果(图2)显示，在镉处理浓度≤10 mg/kg时，叶片电导率有所增加，但变化不显著;镉浓度为50 mg/kg时，电导率上升15.3%，与对照差异显著;当镉浓度增加到 200 mg/kg时其叶片电导率增加了26.0%，与对照差异显著。说明低浓度镉处理下海雀稗叶片的细胞膜系统未受到损伤，而镉浓度＞50 mg/kg时，海雀稗叶片电导率显著增加，细胞膜系统受到损伤。

图2 镉胁迫对海雀稗叶片电导率的影响Fig.2 Effect of Cd stress on the leaf electrical conductivity of P.vaginatum Sw.

2.4 镉胁迫对海雀稗保护酶(SOD、CAT)活性的影响

2.4.1 镉胁迫对海雀稗SOD活性的影响 海雀稗中SOD活性变化见图3，镉浓度为1 mg/kg时海雀稗根、茎、叶中SOD活性增加不显著;镉浓度为10 mg/kg时SOD活性在海雀稗根、茎、叶中显著增加，SOD活性分别是对照的1.60倍、2.18倍、2.25倍;镉浓度为200 mg/kg时，海雀稗根和叶片中SOD活性达到最大值，分别是对照的4.92倍、5.58倍。而在茎中当镉浓度为50 mg/kg时，SOD活性达到最大值，其活性是对照的2.34倍，此后随镉浓度增加，茎中SOD活性显著下降。

图3 镉胁迫对海雀稗SOD酶活性的影响Fig.3 Effect of Cd stress on SOD activity in P.vaginatum Sw.

2.4.2 镉胁迫对海雀稗CAT活性的影响 CAT能有效清除过氧化氢对细胞的氧化作用，是植物保护自身免受羟基自由基毒害的关键酶。通过研究镉胁迫对海雀稗CAT活性的影响，发现海雀稗根、茎、叶CAT活性随镉浓度的升高呈先升高后下降的趋势(图4)。当镉浓度为1 mg/kg时，海雀稗根和叶片中CAT活性增加不显著，而在海雀稗茎中CAT活性显著增加;当镉浓度≥10 mg/kg时，根、茎、叶中CAT活性随着镉浓度的增加而显著上升;当镉浓度达到50 mg/kg时，各组织中CAT活性达到最大，分别为对照的2.42倍、19.71倍、4.59倍。当镉浓度≥100 mg/kg时，植物体内CAT活性随镉浓度增加而显著下降，但海雀稗叶片中CAT活性较对照相比，维持在较高水平。

图4 镉胁迫对海雀稗CAT酶活性的影响Fig.4 Effect of Cd stress on CAT activity in P.vaginatum Sw.

2.5 镉胁迫对海雀稗根系活力的影响

根系是植物吸收养分和水分的主要器官，同时也是最先受到镉胁迫的部位，根系活力的强弱直接影响地上部分的生长。如图5所示，当镉浓度为1 mg/kg时，海雀稗根系活力显著上升，其根系活力为对照的1.20倍，此后随镉处理浓度的增加根系活力开始下降。

图5 镉胁迫对海雀稗根系活力的影响Fig.5 Effect of Cd stress on the root vigor of P.vaginatum Sw.

2.6 镉胁迫对海雀稗镉积累特征的影响

镉在海雀稗体内的富集特征如表3所示，随镉胁迫浓度增加，海雀稗地上部分和地下部分镉含量呈增加趋势，但地上部分的增加值远小于地下部分，地下部分镉富集量在各浓度下变化显著。地上部分当镉浓度＞1 mg/kg时，富集系数为0.16～0.31，镉的富集量较低;地下部分在镉处理后，其富集系数为3.92～14.42，根中滞留率＞90%，镉转移系数＜0.10，大量的镉被富集于根部。

表3 镉在海雀稗体内的富集特征Table 3 Enrichment characteristics of Cd in P.vaginatum Sw.responding to Cd treatments

3 讨论

3.1 海雀稗体内MDA含量与耐镉性

重金属对植物的胁迫达到一定程度，细胞内活性氧会增加，促进膜脂过氧化作用，破坏细胞膜系统，膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量增加，细胞膜透性增加，植物的生长受到抑制，表现出相应的毒害症状。如:张超兰等［23］研究镉对4种湿地植物胁迫发现MDA含量随镉浓度增加而升高;王正秋等［24］通过镉对芦荟的胁迫发现，镉胁迫会促使膜透性增大、MDA含量增加。本研究也获得了相似的研究结果，海雀稗MDA含量随镉浓度的增加呈上升趋势，镉浓度≥10 mg/kg时，根系中MDA含量显著增加，茎、叶片中MDA含量分别在镉浓度为100 mg/kg、50 mg/kg才显著增加，表明镉胁迫对海雀稗根、茎、叶的伤害程度不同，根系对重金属镉较为敏感，海雀稗各器官对镉胁迫的忍耐程度为茎＞叶＞根。

3.2 海雀稗体内SOD、CAT活性的变化与耐镉性

重金属胁迫导致植物活性氧代谢失衡，损伤细胞膜系统，是重金属产生毒性的一种机制，植物体内的抗氧化酶系统对于维持活性氧平衡有重要作用［25］。CAT可以和SOD偶联，彻底清除体内活性氧自由基，保护膜系统［26］。赵钢等［27］、朱启红等［28］、陈朝明等［29］、苑丽霞等［30］对苦荞、蜈蚣草、桑树、油菜的研究发现，低浓度重金属胁迫会促进SOD、CAT等保护酶活性增强，有助于清除体内活性氧自由基，减轻重金属对植物的毒害作用，高浓度重金属胁迫会使SOD、CAT等保护酶活性降低或失活，进而不能清除活性氧自由基对植物的毒害，植物生长受到抑制。这与本研究结果相似，在海雀稗根、叶片中SOD活性随镉浓度的增加而上升，而在茎中SOD活性在镉浓度为50 mg/kg时达到最大，之后开始明显下降，可能是因为茎中活性氧的过量积累抑制了SOD活性。CAT活性随镉浓度的增加呈先上升后降低的变化，镉浓度为50 mg/kg时，CAT活性达到最大，可能是低浓度镉胁迫下海雀稗体内活性氧积累增加导致CAT活性的提高，有利于对活性氧的清除，因而此时根系活力维持在较高水平，植株正常生长，海雀稗对镉的耐受能力增强。当镉浓度＞50 mg/kg时，活性氧的过量积累导致CAT活性受到抑制，活性氧平衡受到破坏，从而使海雀稗表现出相应的镉毒害症状，生物量、根系活力降低，MDA含量显著增加，生长受到抑制。

3.3 海雀稗镉的富集特征

镉向海雀稗地上部分转运能力较弱，镉胁迫下海雀稗根系滞留率＞90%，转移系数、地上部分富集系数、富集量较小，大量的镉积累于海雀稗根部，而从镉胁迫与植物生长来看，海雀稗对镉胁迫具有一定的耐性。蓖麻在镉浓度为200 mg/kg时，其根部镉含量仅为521.50 mg/kg［31］。有研究发现豆科植物镉迁移到茎叶中的量仅占根吸收的2%［32］，这些研究结果与本研究结果相似，而有研究报道胡萝卜和烟草叶片中镉富集量高于根［33］，说明镉在植物中的积累分布与植物种类有关。

综上所述，当镉浓度≤50 mg/kg时，海雀稗株高、根长、植株鲜质量未明显下降，根系活力未显著下降，植物体内保护酶活性(SOD、CAT)随镉浓度的增加而增强，能有效清除植物体内的活性氧，活性氧代谢平衡未受到破坏，膜脂过氧化产物(MDA)的积累和膜透性未明显增加，此时海雀稗细胞膜系统未受到严重损伤，海雀稗生长正常。镉浓度＞50 mg/kg时，随镉浓度的增加，植物体内产生更多的活性氧，CAT活性显著下降，SOD与CAT的协同作用大大降低，不能维持植物体内的活性氧平衡，植物细胞膜受到破坏，MDA大量积累，根系活力下降，海雀稗生长受到显著抑制。海雀稗根系对镉具有很强的富集能力，可利用海雀稗固定镉污染土壤中的镉，减轻土壤中镉的淋溶及污染土壤的流失，控制镉污染的扩散。因此海雀稗可以作为重金属镉污染土壤修复的候选植物。

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