去皮姜提取物抑制食品大肠菌群的处理条件优化

范紫煊，刘绍军，黄 萱

(河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛，066600)



去皮姜提取物抑制食品大肠菌群的处理条件优化

范紫煊，刘绍军*，黄 萱

(河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛，066600)

以pH值、滤纸片浸泡时间、提取物浓度为试验因素, 采用响应面分析法，以抑制大肠菌群的抑菌圈半径为评价指标，对去皮姜提取物抑制食品大肠菌群的处理条件进行研究。结果表明，最佳处理条件为：pH值7.0，滤纸片浸泡时间46 min，提取物质量浓度310 g/L，实际测得抑菌圈半径为18.36 mm，与模型预测值基本相符。

去皮姜；大肠菌群；抑菌效果

随着人们食品安全意识的加强，人们更加青睐于选择绿色、天然、安全的食品[1]。生姜及其提取物具有独特的香气和辣味,并且可以作为防腐剂、保鲜剂、护色剂，因此，对于生姜提取物的研究有着极高的开发利用价值和应用前景[2，3]。目前，我国食品添加剂种类很多，但都有各自的问题，例如：苯甲酸及其钠盐和山梨酸及其钾盐的防腐效果受pH值影响[4]；亚硫酸及其钠盐会有残存二氧化硫影响身体健康的问题[5]；乳酸链球菌素的抑菌范围较窄[6]；纳他霉素因产量有限，产业化生产还是受到限制[7]。因此研发出更有效的，应用范围广、人体伤害性低、价格低廉的天然防腐抑菌剂是十分有必要的。对于生姜提取物抑菌方面研究发现，生姜秸秆提取物有明显的抑制食品中大肠菌群的作用，每年生姜收获后,都有大量的生姜秸秆或堆放于路边、或就地焚烧，不仅给道路交通造成安全隐患，而且由于焚烧生姜秸秆造成的烟雾给环境造成了严重的污染，影响周边群众的生活[8]。因此，在pH值、滤纸片浸泡时间及提取物浓度3个单因素实验的基础上, 采用响应面分析法, 以抑菌圈半径为评价指标，对生姜秸秆提取物抑制食品大肠菌群的处理条件进行了研究，为开发生姜秸秆提取物为天然防腐剂提供理论基础。

响应面分析法(Response Surface Method)采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，将多因子试验中因子与指标的相互关系用多项式近拟，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系，并依此从响应面的形状上找到最佳控制点。当曲面形状复杂，即在设计的影响因素的不同水平中无最佳控制点时，还可通过岭嵴分析，在试验范围之外找到最佳控制条件[9]。本次研究在pH值、滤纸片浸泡时间及提取物浓度3个单因素实验的基础上，采用响应面分析法，以抑菌圈半径为评价指标，对去皮姜提取物抑制食品大肠菌群的处理条件进行了研究。

1 实验材料与方法方法

1.1 实验材料与设备

去皮姜取自抚宁，烘干，过筛(筛孔尺寸：30 mm)，制成去皮姜粉，体积分数为0.75的乙醇(A.R级),结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)(生化级试剂)。

大肠菌群由河北科技师范学院微生物实验室提供。

HH-4数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司生产；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；DL-1万用电炉，北京市永光明医疗仪器厂生产；HC014-11-018-01(X)手提式高压蒸汽消毒器，上海东亚压力容器制造有限公司生产；JSP-200型高速多功能粉碎机，浙江省永康市金穗机械制造厂生产；SW-CJ-1B型单人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司生产；AL104电子天平，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司生产；V1全自动菌落计数仪，杭州迅数科技有限公司生产；N-1100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 采用索氏提取法提取去皮姜提取物。称取20 g去皮姜粉用滤纸片包好，放入抽提筒中，在圆底烧瓶中加入体积分数为0.75的乙醇，使m(去皮姜粉)∶m(乙醇)=1∶12。连接好装置，将圆底烧瓶放入50 ℃恒温水浴锅中，提取3 h后，旋转蒸发至干，得到棕黄色的油状液体。

1.2.2 抑菌试验 将直径10 mm的滤纸片浸泡去皮姜提取物30 min，取浓度为10-5cfu/L的菌悬液，进行抑制食品大肠菌群的测定。使用V1全自动菌落计数仪拍照并进行对抑菌圈半径的测定。

1.2.3 单因素试验 以pH值、滤纸片浸泡时间和提取物质量浓度做单因素试验。①去皮姜提取物的pH值对大肠菌群抑菌作用的影响。称取去皮姜提取物0.5 g，加入0.5 mL水，混匀。使用0.1 mol/L HCl溶液、0.1 mol/L NaOH溶液调整去皮姜提取物pH值至3，5，7，9，11。吸取0.1 mL 10-5cfu/L浓度的大肠菌群菌悬液涂布于VRBA培养基，将直径10 mm的滤纸片分别浸泡在不同的去皮姜提取物溶液中60 min，取出放在培养基中间，倒置培养24 h。②滤纸片浸泡时间对去皮姜提取物对大肠菌群抑菌作用的影响。称取去皮姜提取物0.5 g，加入0.5 mL水，混匀，使其质量浓度为1 000 g/L，调整pH值为7。吸取0.1 mL 10-5cfu/L浓度的大肠菌群菌悬液涂布于VRBA培养基。将直径10 mm的滤纸片分别浸泡在不同的去皮姜提取物溶液中5，15，30，45，60 min，取出放在培养基中间，倒置培养24 h。③提取物质量浓度对去皮姜提取物对大肠菌群抑菌作用的影响。称取去皮姜提取物0.5 g，加入0.5 mL水，混匀。梯度稀释去皮姜质量浓度至1 000，500，250，125，62.5 g/L，调整pH值为7。吸取0.1 mL 10-5cfu/L的大肠菌群菌悬液涂布于VRBA培养基。将直径10 mm的滤纸片分别浸泡不同质量浓度的去皮姜提取物溶液中45 min，取出放在培养基中间，倒置培养24 h。以上实验测定抑菌圈半径时，均重复3次取平均值。

1.2.4 响应面优化试验 根据单因素试验结果，选取影响抑制大肠菌群效果比较显著的3个因素：pH值、滤纸片浸泡时间和提取物质量浓度，采用3因素3水平的Box-Behnken 响应面实验设计(表1)，共有17个试验点，其中析因点为12个，中心点为5个。

表1 去皮姜提取物抑制食品大肠菌群的响应面分析因素与水平设计

2 实验结果

2.1 单因素实验结果

2.1.1 去皮姜提取物的pH值对大肠菌群抑菌作用的影响 当去皮姜提取物pH值为3～7时，对大肠菌群抑菌圈半径逐渐上升；pH为7时达到最大值；pH值为7～9时，抑菌圈半径下降(图1)。偏酸偏碱可能都破坏生姜提取物中的抑菌有效成分，对抑菌效果均有不利影响，故选择pH 7为去皮姜提取物抑制大肠菌群的最佳值。

2.1.2 滤纸片浸泡时间对去皮姜提取物对大肠菌群抑菌作用的影响 在滤纸片浸泡时间为5～45 min时，去皮姜提取物对大肠菌群抑菌效果随浸泡时间增加而升高(图2)，这是由于生姜提取物中的抑菌有效成分渗入到了滤纸片中，当浸泡时间为45 min时，有效成分渗透完全，抑菌圈半径达到最大值，超过45 min后，有效成分饱和后随时间增加而流失一部分，因此效果下降，故选择45 min为最佳滤纸片浸泡时间。

图1 去皮姜提取物pH值对大肠菌群抑菌作用的影响 图2 滤纸片浸泡时间对大肠菌群抑菌作用的影响

2.1.3 去皮姜提取物质量浓度对大肠菌群抑菌作用的影响 在去皮姜提取物质量浓度为1 000～250 g/L时，抑菌圈半径呈上升趋势；在质量浓度为250～62.5 g/L时，抑菌圈半径呈下降趋势；在去皮姜提

图3 去皮姜提取物质量浓度对大肠菌群抑菌作用的影响

取物质量浓度为250 g/L时达到最大值，抑菌效果最佳(图3)。这可能是生姜提取物在低浓度下有效成分不够，不足以破坏食品大肠菌群的结构，当浓度过高时又抑制了有效成分的抑菌作用，故选择250 g/L为去皮姜提取物抑制大肠菌群的最佳质量浓度。

2.2 响应面法优化去皮姜提取物抑制大肠菌群的条件

根据单因素试验结果，选取影响抑制大肠菌群效果比较显著的3个因素：pH值、滤纸片浸泡时间和提取物质量浓度，采用3因素3水平的Box-Behnken 响应面实验设计，共有17 个试验点，其中析因点为 12 个，中心点为 5 个。实验结果见表2。

表2 响应面法优化去皮姜提取物抑制大肠菌群的实验设计与结果

根据表2中的实验数据，采用Design-Expert 8.0.5软件对其进行二次回归拟合，得到的抑菌圈半径R1对pH值(A)、滤纸片浸泡时间(B)、去皮姜提取物质量浓度(C)的回归方程为:

R1=18.87+0.43A+0.69B-0.22C+1.42AB-0.99AC-0.39BC-7.37A2-5.17B2-6.16C2

方程回归分析及方差分析结果表明：pH值的二次项、滤纸片浸泡时间的二次项和提取物浓度的二次项均有极显著影响(表3)。试验中选用的模型P值<0.001具有极显著性，失拟项为0.201 5，<0.050 0，表明失拟不显著；相关系数R2=0.976 5，表明该模型拟合程度良好，可用于优选去皮姜提取物抑制大肠菌群处理条件的理论预测。

表3 回归系数显著性分析

注：***P<0.001为极显著，**P<0.01为非常显著，*P<0.05为显著。

2.3 响应面分析

根据二次回归方程绘制响应面曲线，能得到两个因素交互作用对响应值(抑菌圈半径Y)的影响，结果见图4～图6。比较图4～图6与回归方程各项方差可以看出，各因素对抑菌圈半径的影响由大到小依次为：pH值(A)，提取物浓度(C)，滤纸片浸泡时间(B)；在3个因素中，滤纸片浸泡时间与pH值对响应值的影响曲线较陡，说明滤纸片浸泡时间与pH值交互作用对抑菌圈半径具有影响。

图4 pH值与滤纸片浸泡时间交互作用等高图及3D效果图

图5 pH值与去皮姜提取物质量浓度交互作用等高图及3D效果图

图6 滤纸片浸泡时间与提取物质量浓度交互作用等高图及3D效果图

2.4 验证试验

采用Design-Expert 8.0.5 软件对方程中的R1进行求解，得到去皮姜提取物处理理论最佳工艺的条件为：pH 7.08，滤纸片浸泡时间46.09 min，去皮姜提取物质量浓度310 g/L，在此条件下预测抑菌圈半径可达18.903 6 mm。根据实际操作将最佳条件修改为：采用pH 7.0，滤纸片浸泡时间46 min，去皮姜提取物质量浓度310 g/L，对去皮姜提取物进行3次平行验证试验，实际测得抑菌圈半径平均值为18.36 mm，达到理论值的97.1%。试验结果表明，预测值与实际值的偏差较小，试验优化的参数准确可靠。

4 结 论

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合实验设计,以pH值、滤纸片浸泡时间、提取物质量浓度为试验因素，以抑制大肠菌群的抑菌圈半径为指标,得到数学回归模型，采用Design-Expert 8.0.5软件对方程进行求解，以及综合情况考虑，得到响应面法优化去皮姜提取物抑制大肠菌群的理论最佳处理条件为：pH 7.0，滤纸片浸泡时间46 min，去皮姜提取物质量浓度为310 g/L，测得去皮姜提取物抑制食品中大肠菌群的抑菌圈半径为18.36 mm。经过验证预测值与实际值的偏差较小，试验优化的参数准确可靠，具有实际应用价值。

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[3] 赵德安.思维方式与传统发酵调味品生产工艺[J].中国调味品,2011,36(2):17-19.

[4] 曾正渝.苯甲酸及其钠盐在食品和药品中的应用[J].中国药业,2007,16(6):64.

[5] 陈玉梅.亚硫酸盐类在食品中的应用及残留控制[J].检验检疫学刊,2010,20(3):22-24.

[6] 王丽,张毓,陈翠岚.我国食品防腐剂的应用及发展趋势[J].食品安全质量检测学报,2011,2(2):83-87.

[7] 刁益韶,贾萌,朱璐瑶.食品防腐剂的使用现状及安全性分析[J].河北化工, 2012, 35 (10):63-66.

[8] 闫永亮,张秀云.生姜秸秆栽培杏鲍菇培养基优化研究[J].北方园艺,2014(7):140-143.

[9] 王振宇,周芳,赵鑫.响应面分析法优化超声波提取大果沙棘总黄酮工艺[J].中国食品学报,2007,7(6):44-51.

(责任编辑：朱宝昌)

Optimization of Processing Condition of Peeled Ginger Extract Inhibiting Coliform Bacteria in Food

FAN Zi-xuan，LIU Shao-jun，HUANG Xuan

(College of Food Science & Technology,Hebei Normal University of Science & Technology，Qinhuangdao Hebei，066600,China)

Using the response surface analysis and taking the bacteriostatic ring radius of inhabiting coliform bacteria as the evaluation index, the peeled ginger extract inhibiting coliform bacteria in food processing conditions were studied with pH value, filter, soaking time, the concentration of the extract as the test factors. The results showed that the optimum processing conditions is: the pH value 7.0, filter soak time 46 min, concentration of the extract 310 g/L, the actual measured bacteriostatic ring radius 18.36 mm, that are essentially the same with the model prediction.

peeled ginger; coliform bacteria; bacteriostatic effect

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.01.005

范紫煊(1991-),女,在读硕士研究生。主要研究方向：食品加工与安全。

河北省科技支撑计划项目(项目编号：11221002D)。

2015-03-17

S632.5

A

1672-7983(2015)01-0023-06

*通讯作者，男，硕士,教授。主要研究方向：食品加工与安全。E-mail：spxykj@126.com。