不同取样方法对骨小梁结构性质分析的影响

尹鹏滨，吕厚辰，张里程，赵 喆，苏秀云，李 明，张立海，唐佩福

解放军总医院 骨科，北京 100853

基础研究论著

不同取样方法对骨小梁结构性质分析的影响

尹鹏滨，吕厚辰，张里程，赵 喆，苏秀云，李 明，张立海，唐佩福

解放军总医院 骨科，北京 100853

目的为探究可比性更好、定位更精确的骨小梁取样方法提供新思路。方法从样本库中挑选20个髋关节置换术后股骨头标本，将性别相同、年龄相差不超过5岁及股骨头大小相近(直径相差＜2 mm)的标本配成一对，随机分为A、B两组。A组采用标准取样方法，B组采用传统取样方法。对比两种方法取出骨柱在形态结构、轴心平均偏转角、密度值变化3方面的差异。结果传统取样组骨小梁分布不均、走行各异、小梁间延续性差且断端较多。对比标准取样组与传统取样组标本在不同旋转角度下的轴心偏转角度，前者小于后者(P=0.006)。对比骨密度参数差异，两组浅层各骨密度参数值均小于改组深层密度参数值，差异有统计学意义；小梁密度均一系数比较，标准取样组小梁均一系数大于传统取样组，骨密度(bone mineral density，BMD)(P=0.000 8)、骨体积分数(bone volumn/trabecular volumn，BV/TV)(P=0.003 4)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)(P=0.000)、骨小梁数量(trabecularnumber，Tb.N)(P=0.002 9)，差异有统计学意义。结论在对比分析不同个体结构、力学性能等方面的差异时，骨小梁取材部位的差异有可能造成人为偏倚，影响实验结果的准确性和真实性。

骨小梁；骨结构参数；计算机断层摄影术

随人口老龄化加剧，骨质疏松及骨性关节炎等骨骼系统退行性疾病发病率日趋升高，给社会及个人带来严重的健康及经济负担[1-3]。该类疾病常累及股骨头，造成该部位骨松质、软骨下骨等结构发生相应病变[4-5]。利用显微CT(Micro-CT)等影像学手段，分析股骨头内特定类型小梁(压力小梁、张力小梁等)的微观结构、构成成分、机械性能变化，能够为该疾病的早期诊断、完善疾病严重程度分级及预测骨折等并发症发病风险提供重要的参考依据[6-9]。由于骨小梁存在各向异性，其分布数量、密度及走行等不尽相同[10-12]。因此，在对比不同个体相应骨小梁病理或生理状态的变化研究中，精确定位、确保取出相同类型的骨小梁成为首先需要解决的问题。然而，既往研究中利用股骨头表面解剖结构定位所需骨小梁，由于受股骨头标本周围重要解剖标志缺如(如股骨颈、大粗隆等)的制约，难以辨认股骨头在体空间位置，从而影响小梁定位的准确性[13-15]。因此，在运用这部分小梁结构数据进行疾病分析时，可能造成一定的偏倚，使结果偏离真实值。针对这一问题，现有的研究尚未很好地解决。介于此，我们设计了一种基于CT和三维打印技术实现股骨头内任意部位骨小梁精确定位取样的新方案，并以主要压力小梁取材研究为例，评估传统直视下压力小梁取材获得的骨柱与标准的压力骨小梁在形态结构、轴心平均偏转角、密度参数变化3方面的差异，对取材位置引起的误差进行初步探究与分析，并为获得可比性更好、定位更精确的骨小梁标本提供新思路。

材料与方法

1标本来源及分组 收集我院骨科2013 － 2014年临床诊断为骨质疏松性骨折行髋关节置换术后患者的股骨头样本。纳入标准：术前骨密度T值为-3.0 ～ -2.5。排除标准：1)股骨头存在先天畸形，或因坏死、肿瘤等骨质疏松疾病以外因素导致股骨头结构改变者；2)骨折损伤累及股骨头者；3)服用影响骨代谢药物者。按照配对设计的原理，将性别相同、年龄相差不超过5岁及股骨头大小相近(直径相差＜2 mm)的标本配成一对，随机分配至标准取样A组和传统取样B组中。每组10个样本，总计20个样本。

2个性化取样模具的制作 股骨头标本CT扫描：采用0.625 mm层厚，120 kV，740 mA。扫描后(GEDiscoveryCT750HD)，将数据导入Mimics图像处理软件(Mimics 17，Materialise，Belgium)[16]。利用该软件的OnlineReslice功能创建出Interactive MPR，以股骨头小凹为标记点，通过旋转十字准星，确定主要压力小梁最为集中位置所在平面，图1(A ～ E)。在此平面上建立一个半径6 mm、高度12 mm圆柱形标记骨小梁取样部位，使圆柱形CAD对象纵轴与主要压力小梁平行，且位于上述小梁集中平面的中心。将处理后的图像导入3matic软件(3-matic 6.0，Materialise，Belgium)，依据每个股骨头表面形态，拟合出能精确贴附表面的取样模具外形；同时，根据圆柱形CAD对象所标记的取样通道位置和角度信息，确定模具表面取样通道入口大小、角度及位置，完成模具的设计。将模具文件导入3D打印设备(OBJET EDEN 260V，Stratasys Ltd，Rehovot，Israel)，打印出标准化取样模具(Transparent Fullcure®720)[17]。

3骨小梁标本取样 将骨小梁标本取出后恢复至室温，对标准取样组，选用与股骨头标本相对应的标准化取样模具(图1F)，在模具准确对合标本后，借助取样通道的导向作用，引导手术用12 mm无菌环钻以特定角度钻入模具定位的取样区域，获得骨小梁标本；传统取样组，以股骨头凹作为解剖定位标志估计股骨头负重区，在小凹上方约5 mm处，指向股骨头中心，向下取样。取出的骨小梁标本-80℃保存备用。

图 1 Mimics软件下主要压力小梁精确定位及标准取样方法取样A ～ E为主要压力小梁集中平面取样通道CAD对象的建立，F为制作完成的取样模具进行取样的实例(黄色箭头所示为股骨头中心；白色箭头指示主要压力小梁取样；黑色箭头指示标记的取样通道)Fig. 1 Principal compressive trabecular location and sampling assisted by mimics software Establishment of CAD labeled the location of principal compressive tracecular was showed in A-E; F showed an example of the standard method to extract principal compressive tracecular (The yellow arrow showing the center of femoral head, the white arrow showing the principle compressive trabecular, and the red arrow showing the sampling channels)

4骨小梁标本显微CT扫描 将A、B两组标本恢复至室温后，置入专用扫描容器中，沿骨柱长轴采用Micro-CT进行扫描(SkyScan1076；Skyscan，Aartselar，Belgium)[18]。扫描参数如下：X线电压70 kV、电流140 μA、1 mm铝制滤网，旋转角度为0.6°/次投影，旋转180°，图像以256灰阶及18mm像素存储。每次测量前均采用羟基磷灰石体模进行校准。扫描后数据导入Nrecon软件(version 1.6.4.1；Skyscan)重建后，采用Ct-Analyzer软件(version 1.11.8.0；Skyscan)[19]计算相应区域内结构参数。

5轴心偏转角度测量 定义轴心偏转角：骨柱旋转中心轴与压力小梁走行线之间的夹角(图2)。顺时针旋转骨柱，间隔30°选择相应的X线投影，记录轴心偏转角(°)，取绝对值后取均值可得单个样本轴心偏转角。

6Micro-CT感兴趣区域选择及参数计算 扫描后数据导入Nrecon软件(version 1.6.4.1；Skyscan)进行重建，并用Ct-Analyzer软件(version 1.11.8.0；Skyscan)计算标本兴趣区域的三维结构信息，在软骨下皮质骨板下方，沿着骨柱中心线的Z轴，间隔约2 mm(约103张截面图)，依次选取直径6 mm，长度2 mm的感兴趣区域，每个骨柱选择8 ～9块VOI区域分别进行参数运算。计算包括：骨密度值(bone mineral density，BMD)、骨体积分数(BV/ TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)。根据实验设计，将距皮质2 ～ 10 mm定义为浅层小梁，10 ～ 18 mm定义为深层小梁，计算相应参数的浅层/深层的比值以消除个体差异，提高配对两样本间的可比性，评估浅层、深层之间均一系数。

7统计学分析 所有数据均采用SPSS22.0(software 22.0；SPSS，Chicago，IL，USA)软件进行统计分析。定量数据均采用统计。对所得轴心偏转角度数据经正态性及方差齐性检验后，选用重复测量定量资料的方差分析；对骨微结构参数比较依据正态性及方差齐性检验结果，选择采用成组t检验或t’检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1骨小梁标本形态对比 传统取样方式骨小梁分布不均、走行各异，与骨柱纵轴呈不同角度；深层小梁较浅层密集，两者间无明显过渡区；小梁间延续性差，断端较多。相较而言，标准取样组小梁走行均一，与骨柱纵轴平行或呈现较小角度；小梁密集程度随着距皮质深度增加而逐渐增加，延续性较好。见图3。

图 2 轴心偏转角计算示意图(axis deflection angle)骨柱旋转中心轴与压力小梁走行线之间的夹角，分别计算标本在旋转0°、 30°、 60°、 90°、 120°、 150°、 180°轴心偏转角度Fig. 2 Schematic plot showed the measurement of the axis deflection angle Axis deflection angle was measured every 30 degree along the central axis clockwise, namely 0, 30, 60, 90, 120 and 150 degree

图 3 两种取样方法骨小梁结构参数比较距皮质2 ～ 10 mm定义为浅层小梁，10 ～ 18 mm定义为深层小梁Fig. 3 Comparison of bone structural parameters Uniformity coefficient was used to evaluate the uniformity of the extracted trabecular column, and it was defined as the ratio of certain structural parameter from the superior layer (2-10 mm from the cortex) to inferior layer (10-18 mm from the cortex)

2轴心偏转角度比较 轴心偏转角为骨柱旋转中心轴与压力小梁走行线之间的夹角，用以评价骨小梁标本与压力小梁走行的一致性。计算标准取样组与传统取样组标本在旋转0°、30°、60°、90°、120°、150°、180°轴心偏转角度，比较后发现，传统取样组轴心偏转角度大于标准取样组(表1)，差异有统计学意义(P=0.006)。

表1 轴心偏转角对比Tab. 1 Comparison of axis deflection angle

3密度参数变化 分析标准取样组与传统取样组骨微结构参数，两组骨柱的总体趋势为随小梁距皮质深度增加，BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等值呈现升高趋势，在接近股骨头中心位置上述各值达最高。为比较两者骨微结构参数变化特点，遂距皮质2 ～ 10 mm定义为浅层小梁，10 ～ 18 mm定义为深层小梁，比较浅、深层小梁(表2)BMD(PA=0.000 2，PB=0.000 6)、BV/TV(PA＜0.000 1，PB=0.000 2)、Tb.Th(PA=0.016 4，PB=0.000 1)、Tb.N(PA=0.005 0，PB=0.000 2)值，深层均大于浅层。定义密度均一系数为浅层各骨微结构参数除以深层对应参数所得的数值，对比标准取样组小梁均一系数与传统取样组存在差异(表3)，BMD(P=0.000 8)、BV/TV (P=0.003 4)、Tb.Th(P=0.000 0)、Tb.N(P=0.002 9)，前者大于后者。

表2 各组自身浅深层骨结构参数比较Tab. 2 Comparison of bone structural parameters between superior and inferior layer in each group

表3 密度均一系数比较Tab. 3 Comparison of coefficient of uniformity between two groups

讨 论

本实验发现，由于骨结构存在各向异性，肉眼直视下取材难以保证个体间的准确可比。不同个体在结构、力学性能等方面的差异可能来源于两方面：一是由于各自病变的程度不同所引起的真实差异；二是由于取材位置不一致引起的实验误差。而后者的高低将会直接影响到实验结果的准确性和真实性。介于此，实验者设计了一种新型的骨小梁定位取样方法。此种取样方法优于现有文献报道的传统取样方法表现在：1)标准取样方法利用CT数据，实现在三维可视条件下精确定位任意骨小梁，无需依赖股骨头周边如大转子等解剖标志辅助定位，解决了髋关节置换术后标本部分解剖结构缺如以致无法定位的问题。2)利用三维打印技术打印含有取样通道的标准化取样模具，实现导向取样，保证取样结果与CT定位相符。此种取样方法目前尚未见有相关报道。

本实验以主要压力小梁取材研究为例，评估了传统直视下压力小梁取材获得的骨柱与标准的压力骨小梁的差异。定义轴心偏转角为骨柱旋转中心轴与压力小梁走行线之间的夹角，用以评价骨小梁标本与压力小梁走行的一致性。研究发现，传统取样组轴心偏转角度明显大于标准取样组标准压力骨小梁(P=0.006)，表明前者取出骨柱偏离压力小梁走行区域。骨小梁走行差异主要取决于骨力学分布情况[20-22]。离体股骨头标本难以进行力学分布判断，基于表面解剖标志进行判断，属经验性估计结果，较之CT数据下直视定位精确性较差，难以保证取样准确。另外，取样过程中，由于缺乏导向工具，钻取时易出现偏移，使标本偏离压力小梁，造成轴心偏转角度过大。

实验分析了标准取样组与传统取样组Micro-CT扫描获得的骨微结构参数，结果表明，两组骨样均存在一个共同总体趋势，即随小梁距皮质深度增加，BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等值呈现升高的趋势，在接近股骨头中心位置上述各值达最高。上述结果与Chiba等[10]对骨微结构异质性的研究结果一致，即骨质疏松患者股骨头的中心部骨密度参数明显高于其他部位。该分布特点与股骨头力学传导相关，压力小梁及张力小梁在股骨头中心部交汇，令该处骨量高于其他部分[23]。

定义密度均一系数为浅层各骨微结构参数除以深层对应参数所得的数值，该数值越大说明小梁均一性越好，即骨柱包含的小梁类型一致。对比标准取样组小梁均一系数与传统取样组存在差异，前者大于后者，说明传统取样方式获得的骨小梁均一性较差，骨柱中除主要压力小梁外可能还包含其他类型小梁，如非负重区密度值较低的骨小梁，发生了取样偏离。结合各取样部位标准差(s)值，传统取样组s均高于标准取样组，说明应用该方法取得的骨柱间自身差异明显，偏离主要压力小梁的程度不同。

本实验存在以下不足：1)样本数量有限。为减小误差，实验开始前，将患者按年龄、骨密度值与股骨头直径大小进行配对。基于这样的要求，使得在样本库中进行选择时难度较大，限制了入组的样本数量。进一步研究需扩大样本量，增强结论的说服力；2)缺乏健康人群对照。由于受到伦理学限制，所有样本均来自骨质疏松症患者，而缺乏正常健康人的标本作为对照，因而难以判断实验结果是否仅适用于骨质疏松患者，对于正常人群是否存在差异不得而知；3)只评价了传统取样方法在主要压力小梁上取样的结果，对其他类型小梁未进行评估。由于骨小梁取样存在不可重复性，取样后可能会破坏其他类型的骨小梁，因而本次实验仅就主要压力小梁取样进行了对比分析，若要进一步评价传统取样方式取材位置引起的误差，需对其他类型骨小梁如张力小梁等进行全面研究。

综上，传统直视下压力小梁取材获得的骨柱与标准压力骨小梁在形态结构、轴心平均偏转角、密度参数变化3方面均存在明显差异。在对比分析不同个体结构、力学性能等方面的差异时，取材部位的差异有可能造成人为偏倚，影响实验结果的准确性和真实性。

1 Sànchez-Riera L， Wilson N， Kamalaraj N， et al. Osteoporosis and fragility fractures ［J］ . Best Pract Res Clin Rheumatol， 2010， 24（6）：793-810.

2 Svedbom A， Ivergård M， Hernlund E， et al. Epidemiology and economic burden of osteoporosis in Switzerland［J］. Arch Osteoporos， 2014， 9：187.

3 Turkiewicz A， Petersson IF， Björk J， et al. Current and future impact of osteoarthritis on health care： a population-based study with projections to year 2032［J/OL］. http：//www.sciencedirect.com/ science/article/pii/S1063458414011881.

4 Bobinac D， Marinovic M， Bazdulj E， et al. Microstructural alterations of femoral head articular cartilage and subchondral bone in osteoarthritis and osteoporosis［J］. Osteoarthritis Cartilage， 2013，21（11）：1724-1730.

5 Calvo E， Castañeda S， Largo R， et al. Osteoporosis increases the severity of cartilage damage in an experimental model of osteoarthritis in rabbits［J］. Osteoarthritis Cartilage， 2007， 15（1）：69-77.

6 Torres-del-Pliego E， Vilaplana L， Güerri-Fernández R， et al. Measuring bone quality［J］. Curr Rheumatol Rep， 2013， 15（11）：373.

7 Ding M， Odgaard A， Hvid I. Changes in the three-dimensional microstructure of human tibial cancellous bone in early osteoarthritis［J］. J Bone Joint Surg Br， 2003， 85（6）：906-912.

8 Tarantino U， Celi M， Rao C， et al. Hip osteoarthritis and osteoporosis： clinical and histomorphometric considerations［J/ OL］. http：//www.hindawi.com/journals/ije/2014/372021.

9 Rubinacci A， Tresoldi D， Scalco E， et al. Comparative highresolution pQCT analysis of femoral neck indicates different bone mass distribution in osteoporosis and osteoarthritis［J］. Osteoporos Int， 2012， 23（7）：1967-1975.

10 Chiba K， Burghardt AJ， Osaki M， et al. Heterogeneity of bone microstructure in the femoral head in patients with osteoporosis： an ex vivo HR-pQCT study［J］. Bone， 2013， 56（1）：139-146.

11 Chappard D. Bone microarchitecture［J］. Bull Acad Natl Med，2010， 194（8）：1469-1480.

12 Jenkins PJ， Ramaesh R， Pankaj P， et al. A micro-architectural evaluation of osteoporotic human femoral heads to guide implant placement in proximal femoral fractures［J］. Acta Orthop， 2013，84（5）：453-459.

13 Okazaki N， Chiba K， Taguchi K， et al. Trabecular microfractures in the femoral head with osteoporosis： analysis of microcallus formations by synchrotron radiation micro CT［J］. Bone， 2014， 64：82-87.

14 Zupan J， Van’t Hof RJ， Vindišar F， et al. Osteoarthritic versus osteoporotic bone and intra-skeletal variations in normal bone：evaluation with μCT and bone histomorphometry［J］. J Orthop Res， 2013， 31（7）：1059-1066.

15 Zhang ZM， Li ZC， Jiang LS， et al. Micro-CT and mechanical evaluation of subchondral trabecular bone structure between postmenopausal women with osteoarthritis and osteoporosis［J］. Osteoporos Int， 2010， 21（8）：1383-1390.

16 Bunn A， Colwell CW， D’lima DD. Effect of head diameter on passive and active dynamic hip dislocation［J］. J Orthop Res，2014， 32（11）： 1525-1531.

17 Murphy SV， Atala A. 3D bioprinting of tissues and organs［J］. Nat Biotechnol， 2014， 32（8）：773-785.

18 Cui WQ， Won YY， Baek MH， et al. Age-and region-dependent changes in three-dimensional microstructural properties of proximal femoral trabeculae［J］. Osteoporos Int， 2008， 19（11）：1579-1587.

19 Park K， Moon SK， Cho MJ， et al. 3D micro-CT images of ossicles destroyed by middle ear cholesteatoma［J］. Acta Otolaryngol，2004， 124（4）：403-407.

20 Janovic A， Milovanovic P， Saveljic I， et al. Microstructural properties of the mid-facial bones in relation to the distribution of occlusal loading［J］. Bone， 2014， 68（2014）： 108-114.

21 Sverdlova N. Tensile trabeculae - Myth or Reality?［J］. J Musculoskelet Neuronal Interact， 2011， 11（1）： 1-7.

22 Zang JC， Qin SH. From Wolff law， Ilizarov technology to natural reconstruction theory［J］. Zhongguo Gu Shang， 2013， 26（4）：287-290.

23 Shi X， Wang X， Niebur GL. Effects of loading orientation on the morphology of the predicted yielded regions in trabecular bone［J］. Ann Biomed Eng， 2009， 37（2）：354-362.

Effects of different sampling methods on trabecular structure properties

YIN Pengbin, LYU Houchen, ZHANG Licheng, ZHAO Zhe, SU Xiuyun, LI Ming, ZHANG Lihai, TANG Peifu
Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

TANG Peifu. Email: pftang301@126.com

ObjectiveTo provide a novel insight in bone tissue sampling.MethodsTwenty femoral heads were extracted from sample bank of OP patients with femoral neck fracture, and they were matched with the feature of female, age gap less than 5 years and similar size of femoral head (diameter differ less than 2 mm) and were randomly assigned to two groups (A and B). Subchondral bone columns were then extracted from these femoral heads using two different methods (A for standard method while B for conventional method). The morphometric characterization of column specimens, the axis deflection angle and density parameters were compared between two groups.ResultsTrabeculae extracted in conventional way displayed a heterogeneous distribution as long as multiple lacerated ends. The axis deflection angle (ADA, α°) of conventional group was significantly greater than that of standard group (P=0.006). The density parameters in inferior layers were significantly higher than those in superior layers in both groups. The coefficient of uniformity of standard group was significantly better than that of conventional group in bone mineral density (BMD, P=0.000 8), bone / trabecular volumn (BT/TV, P=0.003 4), trabecular thickness (Tb.Th, P=0.000) and trabecular number (Tb.N, P=0.002 9).ConclusionThe inconformity of the spatial position caused by conventional sampling method may affect the evaluation of trabecular microstructure changes, which should be considered as an important experimental bias that will influence the reliability of the results.

bone trabeculae; bone structural parameters; computed tomography

R 68

A

2095-5227(2015)05-0477-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.05.019

时间：2015-01-14 17:19

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150114.1719.002.html

2014-09-24

国家自然科学基金面上项目(31271000)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31271000)

尹鹏滨，男，硕士。研究方向：创伤骨科。Email: yinpe ngbin@gmail.com

唐佩福，男，博士，主任医师，教授。Email: pftang301 @126.com