病变组织细胞免疫组织化学P63/SMA双标记对乳腺癌的诊断效能

摘要:目的探讨P63/平滑肌肌动蛋白(SMA)双标记法免疫组化检查对乳腺癌诊断的效能。方法体检发现乳腺肿块的患者150例，行乳腺针吸检查取病变组织，分别进行HE染色和P63/SMA双标记法免疫组化染色，光镜下观察结果并分析。结果乳腺肌上皮细胞同时表达P63和SMA，非肌上皮细胞均不表达P63。HE染色、P63/ SMA双标记法免疫组化染色检查分别有32例、20例初诊报告为乳腺良性病变，分别有119例、121例初诊报告为可疑癌细胞或发现癌细胞。对比患者手术病理结果，HE染色对乳腺良性病变的诊断准确率为91%，P63/SMA双标记法免疫组化检查为97%; HE染色和P63/SMA双标记法免疫组化检查对乳腺恶性病变的诊断准确率均为100%。结论P63/SMA双标记法免疫组化检查对乳腺癌的确诊率较高，且较HE染色可更好地鉴别乳腺良性病变。

doi: 10．3969/j．issn．1002-266X．2015．015．005

基金项目:河北省卫生厅医学科学研究重点课题计划项目(20090159)。

第一作者简介:王永军(1967-)，主任技师，主要研究方向为临床病理技术。E-mail: wyj5939@126．com

通信作者简介:刘月平(1975-)，博士，主任医师，主要研究方向为临床病理诊断。E-mail: annama@163．com

Diagnostic efficiency of P63/SMA double labeled immunochemistry in lesion tissues of breast cancer

WANG Yong-jun 1，LYN Fei，WANG Xiao-xiao，WANG Ling，DING Chun-yan，FAN Xiao-jie，YANG Hui-chai，LIU Yue-ping

(1 The Fouth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China)

Abstract: Objective To investigate the diagnostic efficiency of P63/smooth muscle actin (SMA) double labeled immunochemistry in lesion tissues of breast cancer．Methods A total of 150 cases of patients with breast disease were selected as the subjects．Needle aspiration was performed to attain the breast specimens．HE staining and double labeled immunohistochemical staining of P63 and SMA were used．The results were observed and analyzed by using light microscope．Results Both P63 and SMA were positive in the vast majority of breast myoepithelial cells and P63 was negative in nonmyoepithelial cells．Thirty-two cases by HE staining and 20 cases by double labeled immunohistochemical staining were diagnosed with benign breast lesions，respectively; and 119 cases by HE staining and 121 cases by double labeled immunohistochemical staining of suspicious carcinoma cells or carcinoma cell were found．When we compared the pathological results，the accuracy rates in diagnosis of benign breast lesions with HE staining and double labeled immunohistochemical staining were 91% and 97%，respectively．The diagnostic accuracy rates of malignant breast lesions were 100% by both HE and double labeled immunohistochemical staining．Conclusion　P63 and SMA double labeled immunohistochemical staining has higher accuracy rate in diagnosis of breast cancer and it could effectively diagnose the benign breast lesions．

Key words: breast neoplasms; breast carcinoma; diagnostic tests; immunohistochemistry; P63 protein; smooth muscle actin

细胞病理学检查技术具有快速、微创、安全等优点，目前已广泛用于乳腺肿块的病理检查，其对乳腺肿块良恶性鉴别、乳腺癌的早期发现有重要价值 ［1，2］。而某些乳腺良性增生和恶性病变由于组织结构复杂、形态变异多样和表现型上相互重叠，常会引起诊断上的争议，其鉴别诊断也常需用免疫组化检查。此外，常用的乳腺针吸法无法获得肿瘤组织的完整结构，对诊断结果也有一定影响。2013年8月～2014年8月，我们采用P63/平滑肌肌动蛋白(SMA)双标记法免疫组化染色以避免涂片中细胞数量和分布不同造成的结果误差，并探讨P63/SMA双标记法免疫组化检查对乳腺癌的诊断效能。

1　资料与方法

1．1　临床资料　河北医科大学第四医院病理科收治的乳腺疾病患者150例，性别均为女性，年龄20 ～68岁。均因发现乳腺肿块需做乳腺针吸检查。121例经病理确诊乳腺癌，余29例为乳腺良性疾病。所有患者行乳腺针吸检查前均未经过任何治疗，均有完整的术后临床病理资料。

1．2　病变乳腺组织的获取　患者取坐式位，用20 mL、7号针头注射器局部消毒，进针后乳腺肿块部位不同深度吸取肿瘤细胞，以提高一次性成功率，将吸取的组织分成2份用95%乙醇固定备用。一份进行HE染色，光镜下进行细胞形态学观察与初步诊断;一份用于免疫组化染色。

1．3　P63/SMA双标记法免疫组化染色方法及结果判定　吸取的肿瘤细胞均匀的涂在防脱片载破片上，95%乙醇固定，0．3% H 2O 2孵育，滴加一抗SMA (1∶100)室温孵育1 h，滴加生物素化二抗，室温孵育15 min，DAB显色，以细胞内出现棕色颗粒判定为阳性细胞，记录结果。后充分蒸馏水洗，0．05% HCl(pH 2．0)洗脱，枸橼酸盐缓冲液高压修复，滴加第二种抗体P63(1∶80)，室温孵育1 h，滴加生物素化二抗，室温孵育20 min，AEC显色，以细胞内观察到红色颗粒为阳性细胞。苏木素复染核，滴加甘油明胶封固。光镜下观察，细胞质呈棕黄色染色为SMA阳性，细胞核呈红色染色为P63阳性。

2　结果

乳腺肌上皮细胞胞质呈棕黄色染色，细胞核呈红色染色，P63、SMA均阳性;而非肌上皮细胞胞质清晰，胞核呈蓝色，不表达P63。P63标记与间质肌纤维母细胞和血管平滑肌细胞无交叉反应; SMA标记肌上皮细胞，与间质肌纤维母细胞和血管平滑肌细胞有交叉反应。

150例乳腺肿物穿刺细胞学HE染色与P63/ SMA双标记法免疫组化检查结果:①HE涂片中32例为增生性腺上皮细胞或伴有轻、中度核异形性细胞;其中30例P63/SMA双标记肌上皮细胞呈散在、簇状或与上皮细胞联结呈团状从而初诊为乳腺良性病变，余2例P63/SMA双标记肌上皮细胞呈间断的细索条状而初诊为可疑癌细胞。②HE涂片中119例表现为异型性明显的上皮细胞或癌细胞;其P63/ SMA双标记肌上皮细胞散在、稀少，簇状者罕见或肌上皮消失，均初诊为可疑癌细胞或找到癌细胞。

150例患者术后病理组织学检查诊断结果: 29例良性病变者确诊为腺病16例、乳腺增生性病变8例、腺肌性腺病5例，其中HE染色诊断准确率为91%，P63/SMA双标记法免疫组化检查的诊断准确率为97%; 121例具有恶性表现者病理确诊为乳腺筛状癌18例、乳腺导管癌伴浸润78例、乳腺浸润性导管癌25例，其中HE染色和P63/SMA双标记法免疫组化检查的诊断准确率均为100%。

3　讨论

双标记法免疫组化染色是在同一组织切片上同时检测两种抗原的免疫组化染色方法，用于多种疾病的诊断 ［3，4］。同一细胞中有两种抗原表达的双重染色法既可减少误差，又便于进行对比性及相关性观察，使获得的结果更加客观和准确 ［5，6］。在乳腺疾病的病理诊断工作中，乳腺肌上皮细胞的正确识别有助于良、恶性上皮性病变的鉴别。SMA标记肌上皮细胞具有较高的敏感性 ［7，8］; P63是乳腺肌上皮常用标记物 ［9，10］，有较强的特异性和敏感性，可用于乳腺病变的辅助诊断 ［11，12］。乳腺肿块针吸检查可为确定肿块性质进而为进一步手术治疗提供依据，但在观察单一HE染色涂片时，由于细胞混杂，特别是乳腺上皮细胞增生活跃时识别细胞的异型程度有些困难 ［13，14］。当在一张涂片中采用P63/SMA双标记法免疫组化染色时，可清楚地标记出乳腺肌上皮细胞 ［15］。根据乳腺肌上皮细胞的分布及表达强弱的数目，对照HE涂片中乳腺上皮细胞的形态变化，有助于更好地鉴别乳腺良恶性病变，诊断准确率高于单行HE染色，不易误诊或漏诊 ［16，17］。本研究结果显示，乳腺肌上皮细胞同时表达P63/SMA，而非肌上皮细胞不表达P63，根据此特点，在镜下可轻易筛选出乳腺肌上皮细胞。我们进一步对照患者手术病理结果，P63/SMA双标记法免疫组化检查对乳腺良性病变的确诊率达97%，高于HE染色(91%)，而两种方法对乳腺恶性病变的确诊率均为100%，故认为P63/SMA双标记法免疫组化检查更有助于鉴别良性乳腺病变。

值得一提的是，在同一张组织切片上两种抗原成分同时显示时，前一种染色所用的抗体系统与后一种染色所用的抗体可能会发生交叉反应，形成叠加染色，影响结果的准确性。为了避免这种交叉反应，我们采用了洗脱法，其原理是在第一次染色完成后用酸性溶液(pH 2．0、0．05% HCl)洗脱涂片上形成的抗原抗体复合物，用该溶液浸染涂片30 min左右可消除第一次染色的抗体系统与下一次染色的交叉反应，且不破坏组织中的抗原成分，并避免洗脱液对下一步所用组织抗原的损害。我们经反复实验测定，发现pH 2．0、0．05% HCl的效果最佳，洗脱时间为30 min，洗脱后经PBS反复冲洗，继续完成第二种染色。

由于细胞涂片要经过两重的免疫组化染色，又要经过高压加热处理，容易出现细胞脱落现象。因此我们建议细胞涂片后要自然晾干再固定，但也不可太干，以看到水分刚好蒸发为宜。另外细胞应涂在涂胶或硅化载玻片上，可防止其脱落。在双标记法免疫组化染色中，两种抗体的使用顺序也很重要。我们将不需抗原修复的SMA抗体用于第一染色，将需热修复的P63抗体用于第二染色，保证了组织对两种抗体的亲和力，且第二抗体的热修复不会影响第一抗体的染色效果，得出的结果较为可靠。