凝血酶抑制剂nexin-1对大鼠脑出血后脑水肿的保护作用机制的研究

陈洪芹

脑出血在临床中有较高的死亡率和致残率，研究表明脑出血后会并发有严重的炎症反应、脑细胞毒性损伤、脑水肿等，其中脑水肿是脑出血最为常见和最为严重的并发症[1]。研究证实脑出血后大量产生的凝血酶会对大脑产生毒性作用并会引起脑组织产生严重的水肿[2]。Caspase-3是机体中特异性的死亡信号转导分子，在细胞凋亡的过程中起到非常重要的作用[3]。有研究表明血脑屏障通透性的异常增加与血脑屏障中的紧密连接复合体的异常变化有关，而Claudin-5和ZO-1是紧密连接复合体重要的组成部分[4-5]。凝血酶抑制剂nexin-1是一种内生的丝氨酸蛋白水解酶，能迅速的抑制凝血酶的表达及活性[6]。本课题组的前期研究已经证实凝血酶抑制剂nexin-1对大鼠脑出血后脑水肿有保护作用，但对于凝血酶抑制剂nexin-1对大鼠脑出血后脑水肿的保护作用的机制还未清楚。因此本文通过检测nexin-1干预脑出血大鼠后相关活性因子水平，来探讨nexin-1保护大鼠脑出血后脑水肿的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取有清洁级的Wistar大鼠90只，雄性，体重200~250 g，实验动物由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，实验大鼠合格证号为SCXK（黑）：2013-002。

1.2 主要试剂及仪器 试剂：凝血酶抑制剂nexin-1（Gibco公司），水合氯醛（山东齐鲁制药厂），伊文思蓝（Bioworlde公司），凝血酶受体兔抗鼠多克隆抗体、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体、Claudin-5兔抗鼠多克隆抗体、ZO-1兔抗鼠多克隆抗体（Bioworlde公司），凝血酶ELISA检测试剂盒。仪器：立体定位仪（Amersham Biosciences公司），分析天平（上海精密科学仪器有限公司），分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），电泳仪（Bio-Rad公司），低温离心机（EPPENDORF公司）。

1.3 动物分组、模型复制及给药 本研究共分为对照组、模型组和干预组，每组大鼠均为30只，每组又根据动物处理时间再分为12、24 h和36 h组，每组每个时间段处理10只。本研究中的模型组和干预组对动物模型复制采用大鼠自体动脉血注射的方法复制脑出血大鼠模型。主要步骤为：将购买的符合体重要求的大鼠适应性喂养1周，用3.5%的水合氯醛腹腔注射的方式麻醉大鼠，将麻醉后的大鼠置于立体定位仪中，在大鼠头皮正中行切口，左侧颅骨钻孔（中线旁开3 mm，前囟前0.2 mm）。用注射器取尾动脉自体血（50 μL），不加抗凝剂。注射器迅速连上针头，将动脉血迅速的注入颅骨下5.5 mm的左侧尾状核。然后换另一侧，尽量减少反流。然后缓慢移出。用骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合头皮。对于对照组大鼠步骤与上述基本一致，只是在尾状核部位注入的是50 μL生理盐水。在对照组和模型组大鼠复制模型的同时往大鼠的尾状核部位注入10 μL的生理盐水，在干预组大鼠复制模型的同时往大鼠的尾状核部注入10 μL的凝血酶抑制剂nexin-1。

1.4 指标检测 各组大鼠在模型复制成功并给药12、24 h和36 h后腹腔注射3.5%的水合氯醛麻醉后迅速断头取出脑组织，其后操作如下。

1.4.1 脑组织中凝血酶受体PAR-1表达水平检测 采用免疫组化法检测各组大鼠脑组织中PAR-1受体的表达情况。将出血侧有针孔的大脑表面冠状切开，取前部脑出血周围厚度为3 mm的脑组织标本，用10%甲醛固定、脱水、包埋，用石蜡切片机对包埋后的脑组织标本进行切片，切片厚度为5 μm，对切再进行脱蜡至水，热修复，过氧化氢封闭内源性过氧化氢酶，滴加PAR-1兔抗鼠多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，冲洗，滴加二抗，冲洗，DAB显色，苏木精复染，PBS返蓝，脱水后封片，显微镜下观察并计算吸光度。

1.4.2 脑组织中Caspase-3、Claudin-5和ZO-1表达水平检测 采用Western Blotting法检测各组大鼠脑组织中Claudin-5和ZO-1表达水平。在冰浴上迅速分离注射部位及周围脑组织，加入适量的裂解液在低温的条件下使用玻璃匀浆器对脑组织进行匀浆，在4 ℃、12 000 r/min的条件下离心5 min，吸取上清液，加入适量的上样缓冲液水煮后用凝胶电泳仪对总蛋白进行分离，将目的蛋白转至NC醋酸纤维素膜上，在5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h，3次洗膜，加入Caspase-3、Claudin-5和ZO-1兔抗鼠多克隆抗体在4 ℃的条件性孵育过夜，3次漂洗，在辣根过氧化物酶标记的二抗中常温下孵育2 h，3次洗膜，涂抹ECL发光试剂，暗室内曝光、拍照，分析目的蛋白和内参蛋白的灰度值并进行统计。

1.5 统计学处理 本研究中所收集到的数据采用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，组间数据比较采用方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PAR-1蛋白表达水平比较 模型组PAR-1的阳性表达水平高于对照组及干预组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；且模型组在造模成功后12 h表达程度最高，随着nexin-1干预时间的延长PAR-1的阳性表达程度呈下降趋势，见表1及图1。

表1 各组PAR-1蛋白表达水平比较（x-±s）

图1 各组大鼠脑组织中PAR-1蛋白表达水平（SP×400）注：A：对照组12 h；B：模型组12 h；C：模型组24 h；D：模型组36 h；E：干预组12 h；F：干预组24 h；G：干预组36 h

2.2 各组Caspase-3表达水平比较 模型组Caspase-3的阳性表达水平高于对照组及干预组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；且模型组在造模成功后12 h表达程度最高，随着nexin-1干预时间的延长Caspase-3的阳性表达程度呈下降趋势，见表2。

表2 各组Caspase-3蛋白表达水平比较（x-±s）

2.3 各组Claudin-5表达水平比较 模型组Claudin-5蛋白表达水平低于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.05），并且模型组Claudin-5蛋白在造模成功后12 h的表达程度最低；干预组Claudin-5蛋白的表达程度高于模型组，比较差异有统计学意义（P<0.05），并且随着nexin-1干预时间的延长Claudin-5蛋白的表达程度呈上升趋势，见表3。

表3 各组Calaudin-5蛋白表达水平比较（x-±s）

2.4 各组ZO-1表达水平比较 模型组ZO-1蛋白表达水平低于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.05），并且模型组ZO-1蛋白在造模成功后12 h的表达程度最低；干预组ZO-1蛋白的表达程度高于模型组，比较差异有统计学意义（P<0.05），并且随着nexin-1干预时间的延长ZO-1蛋白的表达程度呈上升趋势，见表4。

表4 各组ZO-1蛋白表达水平比较（x-±s）

3 讨论

脑出血是临床中常见的一种脑部疾病，在临床中有较高的死亡率和致残率。研究表明发病30 d内脑出血的死亡率高达50%左右，未死亡的脑出血患者在6个月内仅有20%左右的患者能有功能意义上的恢复[7]。因此寻找有效治疗脑出血的内科治疗方法急为迫切。脑出血后会发生严重的脑水肿，脑水肿会致使脑神经细胞产生不可逆的凋亡[8]。已经有研究表明脑出血后产生的血肿块可以诱发产生大量的凝血酶。凝血酶在正常人群的大脑中很难被检测出来，但是在脑出血患者的机体中会被检测出来[9]。小剂量的凝血酶可以保护脑出血的脑组织[10-11]。这主要是因为三点：（1）小剂量的凝血酶可以保护脑神经细胞和脑星形细胞，避免其因为微环境的缺血、缺氧、低血糖而死亡；（2）小剂量的凝血酶可以促进脑胶质细胞合成和分泌神经生长因子，进而促进脑神经细胞的轴突生长；（3）小剂量的凝血酶可以降低出血范围的增加，减轻脑水肿。而大剂量的凝血酶在脑出血有严重的毒性，大剂量的凝血酶会促进脑出血后脑神经细胞损伤、脑血肿、炎症、脑神经细胞凋亡等[12]。动物实验的研究结果已经表明脑出血后并发的脑水肿主要是由于大量的凝血酶产生的毒性作用所引起的[13]。因此抗凝血酶成为目前治疗脑出血及其并发症的一个非常重要的新型的治疗方向。本课题组的前期已经研究证实凝血酶抑制剂nexin-1对脑出血大鼠有很好的保护作用，可以改善脑出血后脑组织的病理损伤，减缓脑出血后脑组织神经细胞凋亡程度，降低脑出血后血脑屏障通透性和脑组织含水量。

大剂量的凝血酶在脑出血后脑组织神经细胞凋亡和脑水肿的过程中起重要的作用，主要是由于凝血酶有凝血酶受体介导诸多的活性物质而引起一系列的生化反应而产生的[14]。凝血酶受体（PAR）是一种蛋白激酶受体，研究发现PAR主要有4种亚型，分别为PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4，其中PAR-2主要是受胰蛋白酶以及凝血因子Ⅶ和Ⅹ激活，而PAR-1、PAR-3和PAR-4是受到凝血酶激活[15]。本研究中受凝血酶抑制剂nexin-1干预的脑出血大鼠脑组织中的PAR-1的表达较模型组显著性降低，比较差异有统计学意义（P<0.05），这说明nexin-1对脑出血大鼠的保护作用可能是与抑制PAR-1的表达有关。

综上所述，凝血酶抑制剂nexin-1对脑出血大鼠的脑组织神经细胞和血脑屏障通透性具有保护作用，可能是通过降低脑组织中的PAR-1、Caspase-3的表达以及升高脑组织中的Claudin-5和ZO-1的表达而起作用。

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