吡非尼酮滴眼液在兔眼小梁切除术后抗瘢痕作用研究*

邵毅，余瑶，裴重刚，胡佩宏，杨璐，黄歆，涂萍

（1.南昌大学第一附属医院 眼科，江西 南昌330006；2.南方医科大学附属南昌第三医院 内分泌科，江西 南昌330009）

术后结膜伤口愈合不良是青光眼滤过术晚期失败的主要原因[1]。有些疤痕体质的患者，尽管使用高浓度的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）或丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）仍可能导致晚期滤过泡形成失败[2]。青光眼滤过术后的伤口瘢痕问题，已成为眼科的热点和难点，因此，寻找安全、有效、副作用小的抗瘢痕药物极为关键[3]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一种新型抗纤维化药物，动物模型和临床试验已证明其具有抗纤维化的潜力[4]。PFD能下调转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）[5]，也可以清除活性氧，从而抑制组织修复[6]。在人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞，PFD可以阻止TGF-β1诱导的纤连蛋白合成[7]。此外，PFD能抑制白介素-1诱导的金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metallopro teinases 1，TIMP1），增加甲状腺相关眼病患者眼眶成纤维细胞的抗纤维化作用[8]。而本研究旨在探讨PFD在兔小梁切除术后抑制结膜滤过泡瘢痕化的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 PFD滴眼液的制备

将PFD粉末（P2116，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）溶解于无菌水中，配成浓度约5mg/ml（0.5%）的溶液，保存于4℃冰箱内，有效时间为24 h。

1.2 手术方法和分组

26只新西兰白兔，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限，检查无眼部疾患及全身器质性疾病。2只作为阴性对照组。所有实验操作过程和方法均遵循ARVO委员会规定的眼科和视觉科学相关的动物使用原则，符合动物伦理委员会标准，并经南昌大学第一附属医院动物伦理委员会许可。兔子饲养在18～25℃标准的恒温动物箱内，12 h光照/黑暗周期，同时给予标准的食物和水进行喂养。24只兔子（24只眼，均为右眼）随机分为两组：所有兔经腹膜内注射戊巴比妥钠（50mg/kg）和局部用0.5%的盐酸丙美卡因表面麻醉，0.5%碘伏消毒。铺巾开睑，剪去第3眼睑，置上、下、内、外直肌牵引线，固定眼球，在显微镜手术条件下，于右眼上象限巩膜区进行常规小梁切除术。约1/2厚的梯形巩膜瓣，大小约4mm×3mm×3mm，切除约1.5mm×3.0mm的小梁组织和部分虹膜组织，用10-0尼龙线缝合巩膜瓣和结膜瓣，手术结束时结膜下注射地塞米松1ml。A组给予0.5%（5mg/ml）PFD滴眼液滴眼，B组给予磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）滴眼，连续使用28 d。所有手术均在手术显微镜（VISU150，卡尔蔡司，德国）下进行，并由同一熟练操作者完成，术后涂红霉素眼药膏。此外，术后1周用诺氟沙星滴眼液点手术眼，3次/d。随访至术后28 d。用0.5%盐酸丙美卡因麻醉后，用Tonocon眼压计记录兔双眼眼压。手术后1、7、14、21和28 d分别观察兔眼滤过泡及并发症，共聚焦显微镜检查兔眼滤过泡情况，同时使用实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对比观察手术区的组织变化。

1.3 共聚焦显微镜检查

采用Confoscan 4裂隙扫描共聚焦显微镜（Nidek Co.LTD，日本）检查。操作步骤[9]：待检兔眼表面麻醉后，将兔头部固定显微镜前，双眼固视正前方，检查者移动镜头使共焦显微镜与结膜上皮细胞接触时，将镜头缓慢向前推进，于结膜滤过泡区进行全层扫描，结束后选择有价值的图像和录像存盘，并计算平均微囊密度及平均微囊面积[10]。

1.4 实时定量逆转录-聚合酶链反应

手术后7、14、21、28和56 d，取滤过泡区的组织（包括结膜、筋膜和巩膜）进行CTGF的RT-PCR[3]。每个时间点得到的组织在1m l提取试剂（Trizol试剂，武汉生命技术有限公司，中国）中匀浆，用cDNA合成试剂盒（Toyobo，日本）合成cDNA。在实时PCR检测系统（SLAN红石医药科技有限公司，中国），使用SYBR预混的Taq试剂盒进行实时PCR测定。通过比较阈值循环方法进行结果分析，并通过管家基因β-actin进行标准化。

1.5 统计学方法

采用Graph Pad Prism 4.00统计软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，比较两组眼压差异、结膜囊泡密度和面积等用单因素方差分析Studentt检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滤过泡情况

A组术后第7天可见有轻微的结膜充血和良好的滤过泡存在，术后14 d，结膜稍充血，滤过泡形成良好，观察28 d后没有明显的炎症反应，滤过泡仍隆起、弥散；B组术后第7天可见结膜充血和良好的滤过泡，术后14 d，结膜充血减轻，滤过泡平坦，瘢痕形成，观察28 d后大部分滤过泡瘢痕化。术后1、7和14 d两组的滤过泡评分比较，差异均无统计学意义（t1d=0.326，t7d=0.652，t14d=0.959，均P>0.05）；术后21和28 d两组的滤过泡评分比较，差异均有统计学意义（t21d=9.142，t28d=15.741，均P<0.05）（见表1）。观察两组无一例眼内炎、前房出血和白内障发生，少数出现伤口一过性的周围角膜水肿。

2.2眼压

手术前和手术后1、7、14、21和28 d的早上8～9点测定眼压。在术前每组眼压与正常对照组比较，均有明显降低（tA=6.732，tB=6.837，均P<0.05）。术后早期眼压明显降低，但随时间延长逐渐升高。术前及术后1和7 d，两组眼压比较，差异均无统计学意义（t术前=0.352，t1d=0.647，t7d=0.753，均P>0.05）；术后14、21和28 d，两组眼压比较，差异均有统计学意义（t14d=3.463，t21d=4.056，t28d=5.194，均P<0.05）。见表2。

2.3 共聚焦显微镜结果

正常结膜上皮基底细胞显示为光暗的细胞体，细胞边界窄（见图1A）。经过0.5%PFD滴眼液处理28 d的A组在结膜滤过泡区上皮及基质层出现了许多大小不一的微囊泡，周边可见部分呈亮光样炎症细胞包绕（见图1B）；而经过PBS处理的B组在结膜滤过泡区上皮及基质层可见少许的小微囊泡及少量的亮光样炎症细胞（见图1C）。通过计数发现，经过治疗28 d后，A组结膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面积分别为（112±22）个/mm2和（28 589±14 268）μm2，而B组结膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面积分别为（26±19）个/mm2和（4 989±2 329）μm2，两组比较差异有统计学意义（tmd=16.842，tma=14.894，均P<0.05，见图1D，1E）。

2.4 mRNA检测

A组术后各时间点在滤过泡区CTGFmRNA表达明显下调，而B组CTGF在滤过泡区CTGF mRNA未见明显改变，两组在各时间点比较差异有统计学意义（t7d=2.476，t14d=4.892，t21d=7.638，t28d=9.452，均P<0.05），见图2。

表1 实验动物术前和术后各时段兔结膜滤过泡评分比较 （n=12，±s）

表1 实验动物术前和术后各时段兔结膜滤过泡评分比较 （n=12，±s）

组别 术前 术后1 d 术后7 d 术后14 d 术后21 d 术后28 d A-3.26±0.14 3.72±0.46 3.66±0.65 4.32±0.64 4.17±0.73 3.36±0.25 3.66±0.38 3.23±0.29 3.18±0.43 2.51±0.37 t值 - 0.326 0.652 0.959 9.142 15.741 P值 - 0.973 0.652 0.326 0.048 0.025 B -

表2 实验动物术前和术后各时段眼压比较 （n=12，mmHg，±s）

表2 实验动物术前和术后各时段眼压比较 （n=12，mmHg，±s）

组别 术前 术后1 d 术后7 d 术后14 d 术后21 d 术后28 d A 16.24±0.26 12.81±0.38 13.26±0.41 13.45±0.36 13.84±0.43 14.15±0.51 17.46±0.22 12.52±0.42 13.52±0.47 14.57±0.52 16.22±0.58 17.28±0.62 t值 0.352 0.647 0.753 3.463 4.056 5.194 P值 0.982 0.864 0.745 0.044 0.028 0.016 B

图1 两组术后28 d兔结膜滤过泡的共焦显微镜图像

图2 两组兔结膜手术区CTGF mRNA表达

3 讨论

青光眼是导致不可逆性盲的主要原因，是仅次于白内障导致失明的第2大常见原因，发病率约为0.21%～1.64%[11]。目前，滤过性手术仍是青光眼的主要治疗手段，但巩膜表层、Tenon囊和球结膜之间成纤维细胞增生、胶原合成增加等，使滤过道瘢痕化而影响其滤过功能[12]，导致手术失败。为了抑制瘢痕形成，防止滤过道瘢痕化，目前术中常用的抗代谢药物如5-FU和MMC均可以防止术后瘢痕形成，但常常会导致结膜泡漏、低眼压、巩膜溶解、眼内炎等并发症[13]。此外，研究者发现皮质类固醇可以减少滤过道纤维细胞增生。尹宝存[14]采用滤过性手术联合局部点用皮质类固醇药物治疗急性闭角型青光眼急性发作及慢性闭角型青光眼，有效地解决了术后炎症和伤口愈合过程中纤维组织增生、滤过道瘢痕化的难题。但其在低浓度时不仅不能抑制成纤维细胞增殖，反而能起到促进作用，局部低浓度滴药造成滤过道的纤维化，而结膜下注射易形成无功能滤过泡，且长期应用并发症多。

术后滤过道瘢痕化是青光眼滤过手术后期失败的主要原因，是眼压长期有效控制和视神经损害保护的一个重大障碍。近年来，抗滤过道瘢痕化药物作用被越来越多的人肯定，手术联合各类抗瘢痕药物的优势也逐渐凸显，在拓宽了手术适应范围的同时，也保证了手术的成功率，增加了青光眼患者复明的希望。PFD在体外的很多细胞（例如肝星状细胞、肾成纤维细胞、子宫肌层细胞及肌瘤细胞）和许多器官（例如肾、肺和肝脏）有抗炎和抗纤维化的作用。目前，PFD在若干临床试验中得到了应用，包括肥厚性心肌病、肺纤维化、神经纤维瘤、子宫平滑肌瘤、特发性硬皮病、硬化性腹膜炎和辐射诱发的纤维化等。虽然PFD在眼部的抗纤维化机制仍不清楚，但有研究表明，PFD能下调人眼球筋膜成纤维细胞TGF-β1的mRNA的表达，对其增殖、迁移及其在体外的胶原收缩具有明显的抑制作用。前期已经研究了青光眼与全身疾病如阿尔默海茨病[15]、帕金森病[16]等的关系，以及一部分抗瘢痕的物质如红花保存羊膜[3]、晶状体前囊膜等[17]在青光眼的应用，目前的初步研究结果发现PFD能调节青光眼小梁切除手术区的巩膜瓣和结膜组织CTGF mRNA的表达，且滤过泡形成良好，有明显的抗瘢痕作用。

总之，本文通过实验对照，发现PFD滴眼液在兔小梁切除术后能减少术后结膜巩膜间的瘢痕愈合。其原因可能是青光眼小梁切除术后滤过泡容易粘连而产生瘢痕化，而PFD滴眼液能有效抗瘢痕，保持滤过道通畅，所以滤过泡存活得更为持久。随着细胞生物学、分子生物学、组织工程学的建立及学科间的交叉发展，阐明青光眼滤过道愈合的过程，进一步研究现有抗纤维化药物抗瘢痕化的作用机制，寻找疗效好、毒副作用小、来源丰富的成分，仍是青光眼术后抗瘢痕化的研究方向。目前，大多数研究还处于体外和动物实验阶段，尚有待于进一步明确PFD对青光眼滤过道瘢痕化作用的相关机制和细胞信号通道，这将为临床随机对照试验的研究奠定可靠的基础。

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