胡杨大片段DNA 转化拟南芥技术体系的优化①

郭妍君，田 蕾，申 健，韩诚武，戚晓利

(佳木斯大学生命科学学院，黑龙江 佳木斯154007)

0 引 言

农杆菌介导是目前研究转基因植物采用的主要方法，高效的农杆菌转化体系对于转基因植物产业化和功能基因组学研究具有重要意义［1］.本课题组承担了国家科研院所公益基金合作项目，以高耐盐胡杨为试验材料，采用可转化人工染色体库技术，将胡杨DNA 大片段转化到模式植物拟南芥中，以构建拟南芥的转化子库，筛选具有潜在育种价值的功能基因，为进一步通过分子育种方法培育新品种提供理论基础和基因资源.由于BIBAC 文库插入的外源基因片段大，构建转化子库的工作量繁重，提高转化效率、简化转化工作尤为重要.

1 试验的材料和方法

1.1 拟南芥的种植

拟南芥种子(Columbia)4℃春化2－4d，播种于培养钵(直径10cm)基质表面，每盆播5－6 点，培养基质为草炭土和蛭石(7:3)混合.覆盖塑料薄膜，置于培养室生长(温度22±2℃，16h 光/8h 暗培养).待花序长出10cm 高时，从主茎基部剪掉花序，当侧生花序长出并基部的花刚刚盛开时进行转化.

1.2 花浸法(Floral Dip)转化拟南芥

载有胡杨大片段DNA 的根癌农杆菌GV3101由中国林业科学研究院提供.将菌液在LB 固体培养基(15mg/l Rif*50mg/lkm)上划线培养.挑取单克隆在LB 液体培养基(15mg/l Rif*50mg/lkm)中28℃摇菌培养1－2 d，待农杆菌生长至OD=1.0左右时离心富集菌体，分别悬浮于含有0，0.05%，0.10%，0.20%，0.25%的Silwet L－77 和5%蔗糖与1/2MS 培养基溶液或5%蔗糖与无菌H2O 溶液中，调OD 值至0.8－1.0 作为渗透液.

按照Clough 方法［2］，选取花期健壮植株，将花序浸泡于渗透液中，浸泡时间分别为浸染1min 隔周后再次浸染或浸染5min 浸染一次.取出后覆保鲜膜暗处横放于塑料盘中16－24h，取出正常培养.收获种子干燥备用.

1.3 转化植株筛选

收获种子用70%的乙醇1mL 消毒30min，无水乙醇1mL 洗2 次，放在超净台灭菌滤纸上晾干.均匀撒到固体筛选培养基(MS，3%蔗糖，pH 5.8，0.8%琼脂，50mg/lkm)表面上，4℃春化2 d，培养室培养.1－2 周后将绿色植株转入土壤中继续生长，统计转化株数.

2 结果和讨论

2.1 农杆菌活化

2.1.1 农杆菌单菌落培养情况

对含有胡杨DNA 大片段的农杆菌进行划线培养以获得单菌落，试验统计了100 个菌种系号，划线结果显示71 个系号成功获得单菌落，失败29个，划线成功率为71%.表明一部分农杆菌因反复冻融、运输、保存等原因导致外源质粒丢失.因此，菌种邮寄尽量选择冬季气温低时进行;收到菌种后及时分装，一部分保存在－80℃，一部分保存在－20℃用于划线培养;操作时菌种严格冰上存放，动作迅速，减少融化的时间及次数.

2.1.2 农杆菌摇菌情况

挑取农杆菌单菌落进行摇菌，试验统计了50个菌号，失败5 个，摇菌成功率为90%.同批次的菌生长速率不同(见图1a)，异常生长出现如豆渣状沉淀(图1b)、球状物等(图1c).YEP 培养基替换LB 培养基后仍出现同样现象.BIBAC 文库插入的外源基因片段大导致生长速率不一致，影响到农杆菌细胞的生长.解决办法是充分预摇，挑取单克隆接种于5mLLB(含15mg/l Rif*50mg/l km)中28℃摇菌培养1－2d，至混浊再按1:50 加新鲜LB扩大培养.同时降低接种量，减少摇菌时间，使用新鲜LB 培养液可减少图1b、c 情况的出现.

图1 不同克隆农杆菌在液态培养基生长情况

2.2 转化体系的优化

2.2.1 表面活性剂Silwet－L 77 浓度对浸染效率的影响

在农杆菌介导的植物转化中，表面活性剂可以通过减小表面张力增加农杆菌在受体细胞上的吸附，提高细胞膜的通透性而增加T－DNA 的转运效率，但浓度太高则引起组织坏死［3，4］.试验比较了5个不同浓度Silwet－L 77 对浸染效率的影响(见图2)，选择5 个克隆号浸染50 株拟南芥，Silwet L－77 的浓度为0.20%时，得到最多的阳性植株.

图2 不同浓度Silwet－L 77 浸染效率

2.2.2 拟南芥浸染悬浮液的成分对转化效率的影响

试验比较了2 种悬浮液的成分对浸染效率的影响(见图3)，用1/2MS 液体培养基和用无菌水作为悬浮液组分得到的阳性植株仅差6 株，统计学分析(t 检验)P ＞0.05，差异不显著.因此用无菌水代替1/2 作为悬浮液组分不影响转化效率，却可很大程度的简化拟南芥浸染工作.

图3 不同悬浮液成分对转化效率的影响

2.2.3 拟南芥浸染时间对转化效率的影响

浸染时间与拟南芥植株健壮程度有关.浸染时间通常情况下浸染1 min，一周后进行二次浸染(方案1).尚爱华等［5］对胡杨大片段DNA 转化效率研究表明渗透液的最适侵染时间40 s 左右，同一株植株浸染三次的转化率较高.而东北地区冬季漫长，室内气温低拟南芥生长健壮［6］，植株浸染5 min 后没有出现生长受阻现象，因此实验比较了浸染5min 浸染1 次(方案2)的转化效率.试验结果见表1，方案2 筛选出的阳性苗数量明显多于方案1.胡杨BIBAC 文库的克隆数多，建立拟南芥转化子库工作量大，本试验数据表明可以通过延长浸染时间，减少侵染次数提高转化工作效率，从而减少工作量.

表1 浸染时间对转化效率的影响

3 结 论

利用农杆菌介导，采用Florial dip 法转化拟南芥的方法既简单且转化率高，有利于大规模构建突变体库及转化子库.但对大片段DNA 转化的效率依旧很低，亟待建立高效的农杆菌转化系统，加快利用基因工程途径对植物遗传修饰的步伐.本研究中转化的胡杨BIBAC 克隆，其中转化拟南芥共计3687 个BIBAC 克隆，1160 个克隆成功得到了转基因拟南芥，只有31.46%的转化成功效率.很大原因是由于BIBAC 文库插入的外源基因片段大，很难进行转化.可通过改善转化条件来增加转化效率，一是减少农杆菌反复冻融的次数，提高农杆菌的质量和减少质粒片段的缺失;二是改善转化浸染条件来提高拟南芥转化效率，实验结果表明渗透剂Silwet L－77 浓度为0.20%、蔗糖5%、无菌水替代1/2MS做悬浮液、浸染5min、浸染一次转化效率最高.

［1］ 叶兴国，王新敏，王轲，等.提高植物农杆菌转化效率辅助策略研究进展［J］.中国农业科学，2012，45(15):3007－3019.

［2］ Clough S，Bent A F.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium－m ediated transformation of Arabidopsis thaliana［J］.Plant Journal，1998，16(6):735－743.

［3］ Kim M J，Baek K，Park C M.Optimization of conditions for transientAgrobacterium－mediated gene expression assays in Arabidopsis［J］.PlantCell Reports，2009，28:1159－1167.

［4］ Cheng M，Fry J E，Pang S，et al.Genetictransformation of Indian isolate of Lemna minor mediated byAgrobacterium tumefaciens and recovery of transgenic plants［J］.Physiology and Molecular Biology of Plants，2011，17(2):129－136.

［5］ 尚爱华，杨雪芹，等.利用花序浸泡法将大片段胡杨基因转入拟南芥［J］.现代农业，2013，8:78－80.

［6］ 戚晓利，赵树堂，韩诚武.东北地区拟南芥室内栽培技术［J］.中国野生植物资源，2014，33(5):64－66.