猪瘟脾淋毒活疫苗中兔瘟外源病毒检测方法的建立及应用

于新友，李天芝，唐 娜，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

猪瘟脾淋毒活疫苗中兔瘟外源病毒检测方法的建立及应用

于新友1，李天芝1，唐 娜2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

为检测商品化猪瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染，根据兔出血症病毒VP60基因保守序列设计引物，建立了检测兔出血症病毒一步法反转录一聚合酶链（RT-PCR）方法，并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对RHDV扩增结果为阳性，对照毒株扩增结果均为阴性；对兔出血症病毒检测的灵敏性为10皮克总RNA量，应用该方法，检测了20批猪瘟脾淋源活疫苗样品，以上结果表明该一步法RT-PCR方法检测速度快、特异性强、敏感性高，可用于猪瘟脾淋毒活疫苗中污染的RHDV外源病毒检测。

猪瘟（Classical swine fever，CSF）又称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种严重危害全世界养猪业高度传染、致死性疾病，我国1984年将猪瘟列为一类动物疫病，兔瘟是由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种兔传染病，该病于1984年在中国江苏部分县市首次暴发，现已扩散到世界各地。疫苗成品出现污染外源性病毒现象常常是因为疫苗生产原材料的污染所引起的，猪瘟脾淋毒活疫苗是以接种猪瘟兔化弱毒的家兔脾脏、淋巴结为原材料制成的，所以猪瘟脾淋毒活疫苗存在污染RHDV的可能性。RHDV发病的家兔死前一般无明显临床症状，不易被发现，一旦感染RHDV家兔的脾淋组织毒混入制备猪瘟脾淋毒活疫苗的抗原中，就会导致疫苗成品污染。笔者在进行猪瘟脾淋毒活疫苗效力检验时，发现其中1批次疫苗注射家兔2日后，家兔突然死亡，诊断为兔瘟病毒感染，于是对疫苗进行各种检验，结果发现疫苗中污染了兔瘟病毒。虽然药典中规定猪瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染的检测方法为家兔注射法，但是我国目前还没有SPF家兔，因此，检测结果可能会受家兔的来源、品种和易感性等影响，且检验成本较高、耗时长，常规的兔瘟病毒检测方法如电镜观察、血凝（血凝抑制）试验等方法存在操作复杂、敏感性低、费时费力等缺点，不能满足猪瘟中RHDV的检测。

本研究根据GenBank公布RHDV基因序列（JF438967），针对具有很高保守性的VP60基因设计1对特异性引物，建立了一种特异、敏感的RHD检测方法，以确保疫苗的安全、有效，为商品化猪瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染提供一种有效的分子生物学检测方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株与病料

兔出血症病毒（RHDV）、兔水疱性口炎病毒（RVSTV）、轮状病毒（RRV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）由本实验室保存，20批猪瘟脾淋源活疫苗样品购买自不同厂家。

1.2 工具酶及试剂盒

AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司、DNA Marker、PCR相关试剂、限制性内切酶、MD18-T载体、DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公司。

1.3 RT-PCR引物设计与合成

参照GenBank中登录的RHDV基因序列（JF438967），采用Primer Premier5.0引物设计软件，设计1对引物，上游引物：5′-GGAACTTGAATGGCAGCAC-3′，下游引物：5′-TAAAGGGCACGAACGACA-3′，扩增RHDV VP60基因部分片段201碱基对，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 病毒基因组RNA的提取

按AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书提取RHDV的RNA，并提取其他几种病毒的RNA。

1.5 RHD VP60基因的一步法RT-PCR扩增及条件优化

以RNA为模板进行一步法RT-PCR扩增，反应体系为20微毫升。各参数为50℃逆转录30分钟，95℃预变性2分钟，然后进入95℃20秒、55℃20秒、72℃20秒，共30个循环，最后72℃延伸8分钟。取4微毫升产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察结果。同时对各扩增条件进行优化，包括退火温度（49℃～59℃梯度温度，每2℃为1个梯度）、引物浓度（0.1～1.1微摩尔/升，每0.2微摩尔/升为1个梯度）等，反应体系均为20微毫升。

1.6 PCR扩增产物的检测及鉴定

首先取扩增产物5微毫升在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与pMD18-T克隆载体在16℃恒温金属浴中过夜连接，转化感受态菌株DH5α。挑取单个的转化菌落，加LB溶液培养18小时后用质粒提取试剂盒抽提质粒，用PCR方法进行鉴定，将阳性克隆送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定，将测序结果与参照的RHDV序列同源性比较。

1.7 特异性试验

分别提取RHDV、RVSTV、RRV、PRRSV、CSFV、PEDV、BVDV的RNA，用已建立的方法进行扩增。

1.8 敏感性试验

RHDV病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀释提取的病毒基因组RNA，使其分别相当于含有100纳克RNA、10纳克RNA、1纳克RNA、100皮克RNA、10皮克RNA、1皮克RNA的含量，分别进行一步法RT-PCR检测，确定其敏感性。

1.9 重复性试验

用建立的一步法RT-PCR检测方法，检测兔出血症、兔水疱性口炎、轮状病毒、猪蓝耳病、猪瘟、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻各3份病料和3份阴性病料，重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1.10 猪瘟脾淋源活疫苗中兔瘟外源病毒的检测

将购买的20批猪瘟脾淋源活疫苗样品稀释为含有1头份/200微升作为检测样品进行一步法RT-PCR扩增，同时设立阳性对照和阴性对照。

2 结果与分析

2.1 扩增产物的检测及鉴定

2.1.1 扩增产物的检测

PCR扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳，扩增产物在201碱基对处可见特异性扩增带，与预期大小相符。

2.1.2 扩增产物的测序鉴定

挑取PCR鉴定阳性的菌液送上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果显示，插入到T载体的基因片段的核苷酸序列与RHDV（登录号：（JF438967）的序列相似性为100％。

2.2 特异性试验

利用设计的引物和确定的最佳扩增条件分别对RHDV、RVSTV、RRV、PRRSV、CSFV、BVDV的RNA进行一步法RT-PCR。结果7个毒株中只有RHDV RNA能扩增出大小为201碱基对目的片段，而其他均未扩增出相应的片段，表明本试验建立的方法有很好的特异性。

2.3 敏感性试验

取5微升PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约201碱基对附近出现特异性条带，与预期产物大小相符。从结果可以看出，引物的一步法RT-PCR检测灵敏度可以达到10皮克RNA。

2.4 重复性试验

经过3次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定、可靠的。

2.5 猪瘟脾淋源活疫苗中RHDV外源病毒的检测

用建立的RHDV一步法RT-PCR检测方法，共检测了20批商品化猪瘟脾淋源活疫苗样品，其中有2批有RHDV污染。

3 讨论

传统RHDV检测方法具有各种弊端，如病毒分离鉴定操作繁琐、鉴定时间长，酶联免疫吸附试验结果重复性不好，血凝试验敏感性低，检验受人为影响因素多，而且对于没有或缺乏血凝活性的RHDV毒株，在生产应用中受到限制。而新发展的荧光定量PCR检测方法虽然有很多优势，但所需仪器比较昂贵，且对操作人员要求较高，不适合大规模推广应用，传统的两部法RT-PCR检测方法时间长，操作繁琐，需要先反转录成cDNA再进行PCR扩增，本试验建立的RHDV一步法RT-PCR检测方法操作简单，不需要单独做反转录，反转录与PCR扩增一步完成，能在3小时内检出RHDV，本试验对扩增的退火温度和引物浓度进行优化，发现只有当退火温度值为56℃时，才能获得较为理想的产物，在引物浓度为0.1～1.1微摩尔/升对PCR扩增效率的影响不大，在0.7微摩尔/升时扩增效率相对较高，而在1.1微摩尔/升时扩增效率低。特异性好，而对常见的兔、猪病毒如RHDV、RVSTV、RRV、PRRSV、JEV、PEDV、BVDV扩增结果为阴性，检测的灵敏度可以达到10皮克RHDV RNA。用建立的RHDV一步法RT-PCR检测方法，共检测了20批商品化猪瘟脾淋源活疫苗样品，其中有2批有RHDV污染。因此，商品化猪瘟脾淋源活兔瘟外源病毒还是很有必要检测的，本试验所建立的方法为猪场基层兽医工作者开展猪瘟活疫苗样品RHDV污染的检测提供了一种简单、有效的分子生物学检测方法。