酶催化光度法测定药物中的双嘧达莫

王 帆,梅玉强,朱文平,3,陈超华,陈亚红,3*

双嘧达莫(Dipyridamole),又名潘丁生,为含氮杂环的嘧啶类合成药物,对冠状血管有较强的扩张作用,可以显著增加冠状脉流量,增加心肌供氧量,并能抑制血小板凝聚,又防止血栓的形成,临床上用于心绞痛、心肌梗塞和冠心病的预防和治疗[1].因此,寻求简便、快速、灵敏的双嘧达莫测定方法意义重大.

目前,关于双嘧达莫的测定方法主要有紫外-可见分光光度法[2]、荧光光谱法[3]、电化学测定法[4]、化学发光分析法[5,6]和高效液相色谱法[7]等.在临床、农业、药物、工业过程检测中,酶催化光度分析法都具有十分广泛的应用[8],采用酶催化光度法测定药物中的双嘧达莫未见相关文献报道.

在p H 9.8的NH-3NH4Cl的缓冲溶液中,双嘧达莫对血红蛋白酶催化体系有较强的抑制作用,据此建立了测定双嘧达莫的酶催化光度分析的新方法.该分析方法设备简单,可操作性强,适合于药剂中双嘧达莫含量的测定,结果令人满意.

1 实验部分

1.1 设备与试剂

S-22PC型分光光度计(上海棱光技术有限公司);UV-530型紫外-可见分光光度计(日本分光公司);电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司);p HS-3C型酸度计(上海理达仪器厂).

牛血红蛋白(美国Sigma公司);酸性铬蓝K(北京化学试剂厂);H2O2溶液.

双嘧达莫(天津一方科技有限公司)标准溶液:准确称取双嘧达莫0.100 0 g,用适量0.01 mol/L的盐酸溶解转移至100 m L容量瓶中,定容,作为储备液,储备液质量浓度为1.0 mg/m L.工作液:用水逐级稀释成100μg/m L,现配现用.

所用试剂均为分析纯,水均为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

在一系列10 m L比色管中按顺序加入p H=9.8的NH3·H2O-NH4Cl缓冲溶液2.0,2.2 m L浓度为2.0×10-4mol/L的酸性铬蓝K溶液,0.9 m L浓度为1.0×10-3mol/L的H2O2溶液,不同浓度的双嘧达莫标准溶液,2.5 m L浓度为5.0×10-6mol/L的牛血红蛋白溶液,用水定容.室温下静置15 min,选择1 cm比色皿,水为参比,于543 nm下测量溶液的吸光度.当溶液中无牛血红蛋白和双嘧达莫时吸光度为A0,当溶液中无双嘧达莫时吸光度为A1,当溶液中有双嘧达莫时吸光度为A2,其抑制率I=(A2-A1)/(A0-A1)×100%,用所得抑制率对双嘧达莫的浓度作标准曲线.

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

血红蛋白能够催化H2O2与酸性铬蓝K的氧化反应.研究发现,双嘧达莫对此光度体系有强烈的抑制作用,吸收光谱如图1所示,最大吸收波长λem=543 nm.由图1可知,双嘧达莫的加入能够显著的抑制该体系的吸光度.

2.2 测定条件的优化

2.2.1 酸度

通过实验分别考查了不同p H的NH3·H2O-NH4Cl缓冲溶液介质的影响.实验结果表明:在p H=9.8的缓冲溶液介质中,双嘧达莫对光度体系的抑制作用最强.因此,实验中选择p H为9.8的NH3·H2O-NH4Cl缓冲溶液.

图1 体系的吸收光谱图

2.2.2 酸性铬蓝用量

分别试验了不同用量的酸性铬蓝K溶液对光度体系的影响.实验结果表明:当酸性铬蓝K溶液的用量逐渐增大时,吸光度逐渐增大.当酸性铬蓝K溶液的用量为2.2 m L时抑制程度最大.当酸性铬蓝K溶液的用量超过2.2 m L时,抑制程度又逐渐减小.所以,酸性铬蓝K溶液的最佳实验用量为2.2 m L.

2.2.3 H2O2用量

分别试验了不同用量的H2O2溶液对抑制体系的影响.结果表明:当H2O2用量逐渐增大时,双嘧达莫对体系的抑制程度也逐渐增大.在H2O2的用量为0.9 m L时,抑制率出现最大值.当H2O2的用量超过0.9 m L时,抑制率反而逐渐减小.因此,H2O2溶液的最佳实验用量为0.9 m L.

2.2.4 血红蛋白用量

分别试验了不同用量的血红蛋白对光度体系的影响.实验表明:当血红蛋白溶液的用量逐渐增大时,双嘧达莫对光度体系的抑制作用也逐渐增大,当血红蛋白溶液的用量为2.5 m L时,双嘧达莫对光度体系的抑制作用最强,随后又逐渐减小.因此,血红蛋白溶液的最佳实验用量为2.5 m L.

2.2.5 反应时间

随着双嘧达莫浓度的逐渐增大,其对光度体系的抑制作用也逐渐增强;同时发现,当反应时间不断延长时,反应速度逐渐减慢,当在室温下反应15 min后,体系逐渐平衡.所以,15 min作为实验的最佳反应时间.

2.3 分析方法特性

双嘧达莫的质量浓度在1.2～29.2μg/m L内与其抑制率I有良好的线性关系.其线性回归方程为:

I%=29.879 1+2.066 1 C(r=0.991 4,n=8)检出限为0.06μg/m L.当双嘧达莫的浓度为3.5 μg/m L时,11次平行测定的相对标准偏差为2.3%.

2.4 共存物质影响

在相对标准误差不大于±5.0%的条件下,考查了十几种常见物质对质量浓度为3.5μg/m L的双嘧达莫的干扰情况,如表1所示.由此可见,上述离子均不干扰测定.

表1 共存物质的影响

2.5 样品分析

取双嘧达莫片20片,除去包衣后,研细,准确称取适量,置100 m L量瓶中,加0.01 mol/L的盐酸溶液适量,摇匀使双嘧达莫溶解,定容,摇匀,过滤.分别量取处理后的滤液和稀释后的双嘧达莫注射液按上述方法进行分析.将上述样品同时进行了对照实验[1],并将两种方法的测定结果进行了统计处理,结果见表2.表中数据表明,此法的结果与标准方法测定结果不存在显著性差异.

表2 样品分析结果(n=5)

3 结论

利用在碱性介质中,血红蛋白酶能够催化酸性铬蓝K,而双嘧达莫对催化体系具有较强的抑制作用.据此,建立了测定双嘧达莫的酶催化光度分析的新方法,测定检出限为0.06μg/m L.该方法容易操作、选择性较好,可用于药剂中双嘧达莫含量的测定,结果满意.

参考文献:

[1]国家药典委员会.中国药典:二部[M].北京:化学工业出版社,2005:62.

[2]王媛.分光光度法测定双嘧达莫含量[J].广东化工,2013,40(7):5455.

[3]颜承农,上官云风,潘祖亭,等.双嘧达莫的荧光光谱分析法[J].分析测试学报,2002,21(3):51-53.

[4]李东辉,孙挺.离子选择电极法测定双嘧达莫的主药[J].华西药学杂志,2008,23(2):195-196.

[5]李云云,章竹君,李冉.化学发光法快速高通量检测双嘧达莫[J].陕西师范大学学报:自然科学版,2012,40(1):46-50.

[6]刘清慧,吕九如,冯娜.铁氰化钾-鲁米诺体系后化学发光反应及其分析应用研究:分子印迹-后化学发光法测定双嘧达莫[J].高等学校化学学报,2008,27(6):1036-1041.

[7]贝琦华,李祎.HPLC法测定双嘧达莫分散片中双嘧达莫的含量及其均匀度[J].中国药房,2012,23(8):746-748.

[8]陈亚红,田丰收,曹丽娟.酶催化动力学光度法测定盐酸多巴胺[J].药物分析杂志,2010,30(2):314-317.