地龙复方止咳、祛痰、平喘药效学研究

宋雯舒，刘顺会*，陈天宇，徐晓鹏

(1.广东药学院 生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006;2.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275)



地龙复方止咳、祛痰、平喘药效学研究

宋雯舒1，刘顺会1*，陈天宇1，徐晓鹏2

(1.广东药学院 生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006;2.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275)

目的：研究地龙复方的止咳、祛痰、平喘作用。方法：分别采用氨水引咳小鼠模型和小鼠酚红排泄试验考察地龙复方的止咳、祛痰作用；采用卵蛋白(OVA)致敏的过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类计数分析，以及支气管及血管周围炎性细胞浸润评分、肺泡灌洗液(BALF)及血清中白介素-4(IL-4)的ELISA分析综合研究其平喘作用。结果：地龙复方能显著延长小鼠咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，增加支气管黏液分泌量，同时能抑制BALF中炎性细胞数增多，减轻小鼠支气管及血管周围的炎性浸润程度，减少BALF及血清中炎性因子IL-4含量。结论：地龙复方能有效减轻气道炎症，并具有一定的止咳、祛痰和平喘效果。

地龙复方；药效学；炙麻黄；甘草；止咳；祛痰；平喘

哮喘是由气道炎性细胞和结构细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等)及细胞组分(cellular elements)参与的气道慢性炎症性疾病[1]。古代医家多认为其病因为痰饮内伏、气因痰阻，而致肺气宣降失常[2]。目前西医临床常规选用吸入性皮质类激素(ICS)治疗哮喘，但长期使用吸入性皮质类激素可能会导致儿童和成人严重骨流失[3]。因此，开发出新型安全有效的平喘药物是解决该类问题的重点。地龙是中医治疗哮喘的常用药，在很多治疗哮喘的方剂中，如五味地龙汤、地龙细辛汤等都含有地龙成分，实践证实其具有较好的平喘作用。笔者经过前期实验证实地龙干粉具有良好的平喘止痉效果[4]，但单独使用地龙的抗炎、祛痰、止咳等效果不佳。地龙和麻黄为常用药对，两药同用，功擅宣肺平喘，适用于痰浊阻塞气道之哮喘病的治疗。褚襄萍等[5]研究表明地龙和麻黄以3∶1比例使用时对离体平滑肌收缩有较好的抑制作用。《金匮要略》《伤寒论》等古籍中均表明麻黄和甘草配伍用药具有一定的利水消肿作用，且现代研究[6]表明麻黄和甘草以2∶1比例配伍使用时有较好的抗炎作用。基于前期研究和文献调研，参考中医药配伍理论，初步拟定地龙复方由地龙、炙麻黄、甘草三味药物组成，比例为6∶2∶1，其中地龙通络平喘，蜜麻黄润肺止咳，甘草补气益中、祛痰止咳并调和药性。本实验通过比较地龙单方与复方在止咳、祛痰及对哮喘小鼠气道炎症方面的作用，考察地龙复方在抗哮喘方面的作用效果，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 动物

昆明小鼠，6周龄，体重18～22g，雌雄兼用，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号为SCXK(粤)2013-0020；SPF级雌性Balb/c小鼠，45只，6周龄，体重18～22g，购自中山大学实验动物中心，生产许可证号SCXK(粤)2011-0029。

1.2 药物

炙麻黄、甘草购自广州采芝林药业，地龙为赤子爱胜蚓(Eisenia Foetida)鲜品，由本实验室提供；地塞米松(0.75mg/片，广东华南药业集团有限公司，批号：130201)；咳特灵片(广州白云山制药总厂，批号：1120444)。

1.3 试剂

酚红(sigma分装)、氨水(天津市百世红有限公司)、碳酸氢钠(成都科龙化工试剂厂)、卵蛋白OVA(sigma公司)、苏木素-伊红(HE)染液试剂盒(南京建成研究所)、小鼠白介素-4ELISA试剂盒(博士德生物)。

1.4 实验仪器

WH-2000超声波雾化器(广东粤华医疗器械有限公司)；759紫外-可见分光光度计(上海菁华科技有限公司)；EG1160型石蜡包埋机(LEICA公司，德国)；RM2255切片机、TEC-2500病理组织漂烘仪(LEICA公司，德国)；Bioquant-Osteo骨形态学图像分析系统(BIOQUAN，USA)；标准酶标仪(Thermo公司)。

2 方法

2.1 试药处理

地龙干燥全粉：取鲜地龙200g，洗净，吐泥24h后，用55℃水烫死，置于55℃恒温烘箱中烘干，得干燥地龙(产率为17.7%)，采用超微粉碎机磨成细粉，得地龙干燥全粉。

炙麻黄甘草浓缩液：取10g炙麻黄、5g甘草分别用100mL和50mL水浸泡过夜，先将炙麻黄煎煮15min，再与甘草混合继续煎煮15min，过滤，滤渣再加150mL水煎煮，重复2次，每次30min，合并3次煎煮液，旋转蒸发至200mL，得炙麻黄甘草浓缩液(相当于生药浓度0.05g/mL)。

2.2 各组动物给药剂量(见表1)2.3 镇咳实验(浓氨水引咳法)[7-8]

昆明种小鼠，体重18～22g，40只，雌雄各半，随机分为5组，即空白对照组(Nor)、地龙组(DL)、炙麻黄甘草提取液组(MG)、地龙复方组(DF)、咳特灵片组(KL)。将小鼠置于1 000mL烧杯中，采用超声波雾化器，以0.5mL/min的速度将浓氨水喷入烧杯内，持续喷雾15s，通入浓氨水时开始观察和记录小鼠的咳嗽潜伏期和3min内咳嗽次数，剔除喷雾3min内咳嗽次数少于10次及多于80次的小鼠。按照表1中的剂量给药，连续灌胃给药5天后，重复上述实验，记录各组小鼠的咳嗽潜伏期(小鼠发生第一次咳嗽反射的时间)和3min内的咳嗽次数。

表1 各组动物给药剂量

注：Nor：空白对照组；DL：地龙组；MG：炙麻黄甘草提取液组；DF：地龙复方组；KL：咳特灵片组。

2.4 小鼠祛痰实验(小鼠酚红排泌法)[9]

昆明种小鼠，体重18～22g，40只，雌雄各半，分组方法同镇咳实验，给药量亦相同，各组小鼠连续给药5天后，末次给药1.5h后腹腔注射1%酚红生理盐水，30min后眼球放血处死小鼠，剪开颈部皮肤，分离气管，在气管甲状软骨下端行气管插管并与注射器相连，用0.8mL 5%NaHCO3溶液缓慢注入气管，然后轻轻吸出，反复灌洗3次，合并灌洗液，1 500r/min离心，取上清，采用分光光度计在545nm波长处检测吸收度(A值)，制备酚红标准曲线，根据酚红标准曲线计算酚红浓度(C)。

2.5 小鼠平喘实验

2.5.1 过敏性哮喘模型建立[10-11]取Balb/c小鼠48只，随机分为6组，即空白对照组(Nor)、过敏性哮喘模型组(M)、阳性药物(地塞米松)组(DM)、地龙组(DL)、炙麻黄甘草提取液组(MG)、地龙复方组(DF)，每组8只，正常饲养7天后，除Nor组小鼠腹腔注射0.2mL pH7.4 的PBS溶液外，其余各组小鼠均于第1、7、14天腹腔注射pH7.4的PBS溶液0.2mL(含有20μg OVA，2mg AL(OH)3凝胶)致敏，从第21天起，除Nor组小鼠单独用等量的pH7.4 PBS雾化外，其余各组小鼠均采用2.5%OVA溶液雾化激发(1.5mL/min，30min/次，3次/周，连续3周)。

2.5.2 给药剂量 Nor组、M组：1mL/kg pH7.4 PBS，其余各组按照表1中剂量给药。

2.5.3 肺泡灌洗液(BALF)分类计数 于最后一次雾化激发24h内，放血处死小鼠，收集血液，气管插管后采用0.8mL PBS进行肺泡灌洗，重复3次，合并3次BALF，3 000r/min离心10min，收集上清液，沉淀加1mL PBS重悬。采用血球计数板计白细胞总数，取200μL涂片瑞士-吉姆萨染色后进行分类计数，计200个细胞，取下左肺，保存于福尔马林溶液中。

2.5.4 气管及血管周围炎性浸润计分 左肺于福尔马林中固定24h后，脱水、浸蜡、石蜡包埋、4μm切片后，脱蜡至水，按照试剂盒说明进行HE染色，显微镜下对支气管进行炎性计分。计分标准为：0分：几乎没有炎性细胞；1分：存在少量炎性细胞；2分：存在一层炎性细胞；3分：存在2～4层炎性细胞；4分：存在4层以上炎性细胞，每个肺部组织至少计10根支气管，直径在10μm左右[12]。

2.5.5 BALF及血清中IL-4含量测定 将血清及BALF样本平衡至室温，按照试剂盒说明进行测定。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 镇咳作用

各给药组小鼠咳嗽潜伏期均有不同程度的延长，与阴性对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；与地龙组、炙麻黄甘草提取液组比较，地龙复方组小鼠咳嗽潜伏期明显延长，差异具有统计学意义(P<0.05)，但与咳特灵组小鼠比较差异不具有统计学意义(P>0.05)。炙麻黄甘草提取液组、地龙组小鼠咳嗽次数与阴性对照组比较差异显著，具有统计学意义(P<0.05)，两组之间比较并无统计学差异(P>0.05)。详见表2。

表2 地龙复方对小鼠咳嗽潜伏期和咳嗽次数的影响 ±s)

注：与空白对照组比较，①P<0.05；与地龙复方组比较，②P<0.05。

3.2 祛痰作用

各给药组小鼠气道酚红排泌量均有不同程度的增加。与阴性对照组比较，地龙组小鼠酚红排泌量增加效果不明显，差异不具有统计学意义(P>0.05)；炙麻黄甘草提取液组、地龙复方组和咳特灵组小鼠酚红排泌量增加效果较为明显，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；与地龙复方组比较，地龙组小鼠酚红排泌量较低，差异具有统计学意义(P<0.05)；炙麻黄甘草提取液组、咳特灵组小鼠酚红排泌量比较差异不具有统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 对小鼠气道酚红排泌量的影响 ±s)

注：与空白对照组比较，①P<0.05；与地龙复方组比较，②P<0.05。酚红标准曲线方程：Y=7.989 69X-0.09 ，r2=0.999 77。

3.3 BALF中细胞分类计数

各给药组与模型组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数、淋巴细胞数均有不同程度的减少，其中地龙复方组和地塞米松组小鼠细胞数量变化较为明显，与其他组小鼠比较差异具有统计学意义(P<0.05)。地龙复方组和地塞米松组小鼠各细胞分类计数比较差异不具有统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 OVA致敏的过敏性哮喘小鼠BALF中细胞分类计数 个/mL)

注：与模型组比较，①P<0.05；与地塞米松组比较，②P<0.05；与空白对照组比较，③P<0.05。

3.4 血管及支气管周围炎性计分

图1结果表明，地龙复方组小鼠支血管及支气管周围炎性计分与模型组比较差异显著，具有统计学意义(P<0.05)，说明造模成功。各给药组小鼠血管及支气管周围炎性计分均较模型组有所减轻，其中地塞米松组和地龙复方组小鼠改善最为明显。地龙复方组小鼠炎性计分与地塞米松组比较差异显著，具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

3.5 ELISA法测定小鼠血清及BALF中IL-4浓度

各给药组及空白对照组小鼠血清及BALF中IL-4含量与模型组比较均有不同程度的减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。与地塞米松组比较，地龙复方组小鼠BALF中IL-4含量较高，差异具有统计学意义(P<0.05)，但血清中IL-4含量差异不明显，不具有统计学意义(P>0.05)。见表5。

4 讨论

地龙作为中医治疗哮喘的传统用药，无论是复方还是单方入药都显示出一定的治疗效果。利红宇等[13]研究表明，蛤粉制广地龙的止咳、祛痰、平喘效果最好，净制广地龙有一定的平喘效果，但止咳、祛痰效果不佳。吴世满[14]研究发现给予哮喘大鼠腹腔注射地龙注射液可缓解其支气管痉挛，降低气道阻力，改善肺功能。王文英等[15-16]研究表明五味地龙汤水煎液能延长豚鼠的哮喘潜伏期，抑制平滑肌收缩，减少肺溢流量，减轻EOS浸润抗气道炎症。陈根生[17]采用麻桑地龙汤治疗小儿哮喘，痊愈38例，好转10例，无效2例，总有效率为96%。

地龙复方在止咳、祛痰、平喘方面均较单独使用地龙效果显著。地龙本身具有良好的平喘、止痉效果，麻黄、甘草共煎液可抑制炎症渗出和炎性细胞吸附和聚集，具有良好的抗炎作用[18]。复方中改麻黄为炙麻黄，因其性温偏润，辛散发汗作用较麻黄缓和，并增强了润肺止咳之功，以宣肺平喘止咳力胜，麻黄和地龙两药同用，其配伍关系为相反药对中的升降相反，属于寒温并用之法，还可抑制麻黄升高血压和引起心悸的副作用[19]，同时配合甘草以调和药性，改善地龙本身的腥臭之气。

图1 血管及支气管周围炎性浸润计分

分组数量(n)血清中IL-4BALF中IL-4M819.40±3.05②40.48±1.76②③DM89.37±0.96①18.71±2.14①③DL817.02±1.46①②③32.06±4.24①②③MG816.36±1.88①②③27.61±2.14①②③DF811.48±2.60①③23.15±3.68①②③Nor87.96±0.656①9.98±1.42①

注：与模型组比较，①P<0.05；与地塞米松组比较，②P<0.05；与空白对照组比较，③P<0.05。

本实验研究结果表明，地龙复方在止咳、祛痰方面能显著延长小鼠咳嗽潜伏期并减少咳嗽次数，增加气道酚红排泌量；在平喘方面可有效减轻哮喘小鼠血管及支气管周围的炎性浸润，减少BALF中各类炎性细胞数尤其是嗜酸性粒细胞的数量，降低血清及BALF中IL-4含量。观察实验过程中小鼠的生存状况可知，地龙复方组小鼠生理状况良好，活泼好动，体重稳定增加，而地塞米松组小鼠体形消瘦、急躁、易怒、体重下降，表明长期应用糖皮质激素类药物可对生长发育造成一定的影响。但地龙复方组小鼠在抑制BALF各类炎症细胞数量增多上与阳性药物组比较仍存在一些差异，可能是地龙复方作用效果较为缓慢，给药时间需进一步延长，其效果才更为显著。

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(责任编辑：尹晨茹)

Pharmacodynamics Study on Earthworm Compound Preventing Cough,Removing phlegm and Relieving Asthma

Song Wenshu1,Liu Shunhui1*,Chen Tianyu1,Xu Xiaopeng2

(1.School of Life Sciences and Biopharmaceutics,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China；2.School of Life Sciences,SunYat sen University,Guangzhou 510275,China)

Objective:To investigate the antitussive,expectorant and antiasthmatic effects of the earthworm compound.Methods:Tussive model induced by nebulization of strong aqua ammonia and expectorant model induced by phenol red in mice were used to investigate the antitussive and expectorant effects respectively;For investigating the antiasthmatic effect,an allergic asthma model sensitized with ovalbumin(OVA) was applied as well as inflammatory invasion scoring and IL-4 ELISA analysis.Results:Earthworm compound could prolong the mice cough incubation period,decrease the frequency of cough and increase bronchial mucus secretion,and at the same time,it could inhibit the increase of inflammatory cells in BALF,reduce the degree of inflammatory infiltrate around the bronchi and vessels in mice.Conclusion:Earthworm compound has certain effects on relieving cough,eliminating phlegm and asthma,especially reducing airway inflammation.

Earthworm Compound;Ephedra;Liquorice;Antitussive;Expectorant;Antiasthma

2014-11-03

国家自然科学青年基金(30901114)

宋雯舒(1988-)，女，广东药学院硕士研究生，研究方向为药理学。E-mail: songwenshu0817@126.com

刘顺会(1971-)，男，博士，广东药学院副教授，硕士生导师，研究方向为药物信息学。E-mail: lshhsl00@163.com

R285.5

A

1673-2197(2015)06-0001-04

10.11954/ytctyy.201506001