东洲岛丝瓜田根结线虫病害的调查与研究

李玉中，王 丽，陈晓华，滕 涛，周东升，刘 最，王 彤

（1.衡阳师范学院 生命科学系 湖南 衡阳 421008；2.蒸湘区西站路小学 科学教研组 湖南 衡阳 421001）

植物寄生线虫是一类重要的植物病原物，每年给全球农业造成约1570亿美元的经济损失［1］。常见根结线虫有四个种类即南方根结线虫（M.incognita）、北方根结线虫（M.hapla）、爪哇根结线虫（M.javanica）和花生根结线虫（M.arenaria）。据不完全统计，根结线虫的寄主植物多达3000多种，包括经济、粮食、果树、蔬菜、花卉等作物，其中危害最为严重的是茄科、葫芦科和十字花科等植物［2－3］。发病田的寄主常年减产15%～20%，严重时达到70%以上［4］。2011—2013年，在衡阳地区果蔬病害的调查过程中，发现东洲岛丝瓜上根结线虫病害发生严重，缩短了丝瓜的挂果期，降低了丝瓜的产量和品质。本文对引起该病的病原进行了鉴定，对发病土壤和病根的优势真菌进行了分离鉴定，并测定了其对致病线虫卵孵化的影响。分析了发病严重的原因，为今后东洲岛根结线虫病的防治提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病样

感染根结线虫病害的东洲岛丝瓜根及其根际土壤。

1.1.2 培养基及配制

玉米粉琼脂培养基：称取20g玉米粉，加入1000mL蒸馏水，微火煮沸30min后，经过4层纱布过滤，加琼脂粉17g后融化补足水量至1000mL。

马丁氏琼脂培养基：称取葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸氢钾1g、氯化镁0.5g依次加入700mL的蒸馏水中加热待融化后加入16g琼脂粉补足水至1000mL。

马丁氏液体培养基：称取葡萄糖5g加入400mL自来水中，之后依次加入蛋白胨0.25g，磷酸二氢钾0.5g，氯化镁0.25g定容至500mL。

以上培养基配制好后分装三角瓶，121℃灭菌20min，取出待用。

双抗玉米粉琼脂培养基：在倒平板前，每100mL培养基中加0.02g青霉素和0.02g硫酸链霉素。

1.2 方法

1.2.1 田间病害调查及样品采集

每年丝瓜收获末期，在东洲岛大面积种植丝瓜的地块进行5点取样，每点取10株，共调查50株。将调查株连根拔起，根据冯志新的根结9级记载标准［5－6］，记录根结发生情况。利用下面公式计算根结指数和发病率，并拍摄田间发病症状。

采集发病严重的丝瓜根及其根际土样，分装于自封袋中，带回实验室放于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 病原线虫的分离和鉴定

将病根用自来水冲洗表面附着的土壤或杂质，置于培养皿中，加少许清水，在体式显微镜下，用挑针挑取病原线虫雌虫放于滴有1小滴1%肥皂的载玻片上，在体式显微镜下，用解剖刀去掉雌虫头部，适当挤压去掉雌虫体内的组织，切除尾部多余的部分，使得留下略大于会阴花纹大小的一层角质膜，使切口向下，盖上盖玻片，放在显微镜下用40倍镜进行观察。根据会阴花纹的形态特征鉴定根结线虫的种类。

1.2.3 发病田优势真菌的分离和鉴定

将田间采集的病根，自来水冲洗，在体式显微镜下挑取颜色较深的卵块和成虫。将挑取到的卵块用1%NaClO消毒3min，并用力振荡使卵粒分散，再经灭菌水冲洗3次，获得表面消毒卵粒。将表面消毒的卵粒、直接挑到的成虫和颜色较深的卵囊分别接入双抗玉米粉琼脂培养基平板上，25℃培养3—5d，待在其周围长出菌丝，从菌落边缘挑取少量菌丝至马丁氏培养基纯化保存。

土壤中真菌的分离参考李玉中等人［7］的方法，将从线虫体和土壤分离到的真菌进行纯化培养，根据菌落特征、菌丝形态、分生孢子形态及其大小等进行鉴定。

1.2.4 优势真菌对根结线虫卵的寄生性测定

卵的获取方法：取田间病根在显微镜下挑取卵囊完好的卵块，消毒方法同1.2.3，经表面消毒卵粒用无菌水洗3次，再滴加无菌水配制成2000个／m L卵悬浮液。

卵致病性测定参考刘国坤等［9］人的方法，并做适当修改。具体做法：优势真菌分离物在马丁氏培养基平板上25℃ 暗培养7d后 ，无菌水漂洗菌落表面，配制孢子悬浮液 （106个／m L）。在直径9 cm培养皿中加人 WA 10mL制平板，其上分散滴加3滴（每滴10μL）镰刀菌孢子悬浮液，封口保湿，25℃暗培养；待产生小菌落后，在菌落边缘滴加10 μL卵悬浮液（每皿加3次），重新封口保湿，25℃暗培养7d后，在倒置显微镜下观察卵的寄生情况，并计算寄生率。

1.2.5 优势真菌发酵液对根结线虫卵孵化的影响

取2mL优势菌株106个／mL的孢子悬液分别加入马丁氏液体培养液中，25℃120r／min培养7d，滤除菌丝，取虑液向直径6cm的培养皿中加入5 ml，再添加30～40个表面消毒的卵粒，封口膜封口，置于25℃培养，培养72h，观察虫卵孵化状况，并计算虫卵孵化率。处理设3个重复，以无菌水为对照。

2 结果与分析

2.1 田间发病情况

东洲岛丝瓜田中发病严重的丝瓜根，其上根结几乎遍布整个根系（图1A）。根结线虫侵染致死的丝瓜根腐烂，且其上长出大量的白色菌丝（图1B）。用带根结的丝瓜根际土壤种植芹菜，可以引起芹菜的严重发病（图1C）。

图1 根结线虫危害症状

连续3年的田间调查表明：东洲岛丝瓜根结线虫病的发病率连年上升，2013年根结发病率达46%，且病情严重，根结指数达45，感病植株的生长周期明显缩短，严重影响了丝瓜的产量。

表1 2011—2013年东洲岛丝瓜田根结发病情况

2.2 雌虫会阴花纹特征

从丝瓜根结中分离的雌成虫透明或呈乳白色，淡黄色，梨形。经会阴花纹观察发现，该虫会阴花纹背弓高耸，似方形，非常明显，背弓由平缓形到波浪形的线纹组成，有些线纹无明显的测线，在线纹的侧面分叉。其特征与王晓玮［10］描述的南方根结线虫会阴花纹特征相似，鉴定此病原为南方根结线虫（Meloidogyne.Incognita）。

2.3 优势菌株的分离鉴定

从直接挑取到的成虫和颜色较深的卵囊分离出的真菌和土壤分离出的优势真菌从形态判断为同一种。该菌在马丁氏琼脂培养基上25℃培养3d，菌落呈白色，菌丝呈密集丝状体，菌丝为无色且有隔。其分生孢子梗直立，圆形，表面光滑或有凸起，孢子大多着生于顶端。分生孢子呈卵形、椭圆形或镰刀形，根据形态初步判断该菌为镰刀菌（Fusarium sp.）（见图2）。

图2 镰刀菌的分生孢子形态

2.4 优势真菌对根结线虫卵的寄生能力

接种南方根结线虫卵7d后，镰刀菌对卵没有明显的寄生现象。有的卵菌丝蔓延于卵壳表面但没有菌丝穿透卵壳，不影响二龄幼虫的孵化。

2.5 优势真菌发酵液对根结线虫卵孵化的影响

镰刀菌的发酵滤液中根结线虫卵的平均孵化率为23.9%，而对照实验组无菌水中卵的平均孵率为10.09%。镰刀菌的发酵滤液对根结线虫卵的孵化有一定的促进作用。（见表2）

3 结论与讨论

（1）本文根据雌虫会阴花纹的形态特征，将衡阳市东洲岛丝瓜根结病原鉴定为南方根结线虫。成飞雪等［11］研究发现，在湖南省侵染蔬菜的根结线虫种类中，南方根结线虫最具普遍性，为优势病原种群，占87%。本研究也证实了这一点，说明南方根结线虫在湖南省发生普遍。

（2）刘国坤等人［9］的研究表明：不同的镰刀菌对卵的寄生能力不同，有的菌株对胚胎期卵的寄生率高达90%，有的分离物对卵无寄生能力。段玉玺等人［12］的研究也证实不同的镰刀菌菌株对南方根结线虫卵的孵化抑制效果不同。本实验从雌虫体、卵块和土壤中分离到的优势真菌为同一镰刀菌，该菌对根结线虫卵无寄生能力，其发酵液对南方根结线虫线虫卵的孵化有一定的促进作用；在根结侵染腐烂的丝瓜根中生长繁茂，对丝瓜根组织腐烂具有一定促进作用，进而促使线虫进入土壤，造成根结线虫的再次侵染，增加了病害的严重度。这可能是导致东洲岛丝瓜田根结线虫病发生严重的原因之一。

（3）莫明和和牟贵平［13］、张克勤［14］等人从全国不同地区采集的土壤及植物根结，分离到多种的根结线虫的天敌真菌，这些真菌对根结线虫的生长和繁殖有重要的抑制作用。本实验在土壤、虫体及卵块和卵上没有分离到根结线虫的天敌菌，这可能与东洲岛特殊的地理环境所致。这可能是导致东洲岛丝瓜田根结线虫病发生严重的另原因之一。

（4）从连续三年的调查显示，该田块根结病害发生逐年呈上升趋势，又鉴于南方根结线虫侵染寄主广泛，且土壤中缺乏自然天敌。建议防治策略：一、实行轮作，改种根结线虫危害小的蔬菜或作物，如空心菜，小白菜等；二，使用药剂处理土壤如阿维菌素，即可降低虫口密度又可减少镰刀菌的数量。

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