新疆墨玉地区维吾尔族成人中、重度慢性牙周炎与雌激素受体基因多态性的相关性研究

王东麟，吴 龙，林 静，赵 今

0 引 言

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是一种口腔常见病、多发病，也被认为是骨疾病的一种，其表现形式为骨质疏松。已有多项研究证实骨质疏松症是牙周病的一项危险因素［1－2］。雌激素可调控骨代谢，具有影响骨生长与变异分化、维持正常的骨转换等多功能作用。雌激素受体(estrogen receptor，ER)是其特异受体，具有组织细胞特异性的ER-α和ER-β 被认为是影响骨量和骨质疏松的潜在候选基因［3］。由于地域、环境、民族等不同，雌激素受体基因多态性与牙周疾病的发生和发展的关系尚未达成一致结论。有文献显示，新疆墨玉地区牙周病发病率高达65.2%［4］。本研究旨在了解新疆墨玉地区维吾尔族成人ERα 与ERβ 基因型的分布情况，探讨ER 基因型与成人慢性牙周炎之间相关性，为该地区维吾尔族成人慢性牙周炎危险性的预测和防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究设计在墨玉地区采用分层随机抽样的方法进行流行病学调查，并收集口腔样本。提取该地区中、重度慢性牙周炎和牙周健康者的全基因组DNA，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法进行基因分型及分析，实验群体选自前期流行病学调查采集样本。总共纳入199 例个体，实验分为牙周炎组和对照组，牙周炎组包括97 例中、重度牙周炎患者(男50 例、女47 例)，对照组包括102 例牙周健康者(男48 例、女54 例)。所有研究对象均为维吾尔族，年龄18 ～70岁。中、重度牙周炎的分型标准:附着水平(attachment level，AL)≥3 mm。牙周炎组纳入标准包括:口内至少有10 颗牙可以进行牙周检查，其中包括4 颗磨牙(不含第三磨牙);③所有牙周炎组个体均无系统性疾病及已知可影响牙周状况的疾病。对照组纳入标准包括:无系统性疾病，口腔卫生情况良好，牙龈无异常，无附着丧失，牙齿无松动，缺失牙不超过3 颗。2 组研究对象均排除怀孕女性并填写知情同意书。本研究通过本院伦理委员会审查(20140529-01)。

1.2 研究方法 采集每位受试者的口腔颊黏膜拭子标本，无菌棉拭子刮取双侧颊黏膜脱落细胞，室温下自然干燥过夜，置于无菌试管中，－20 ℃保存。消毒剪刀将拭子棉絮剥取至离心管，采用口腔拭子基因组DNA 提取试剂盒(北京天根生物有限公司)提取DNA，－20℃保存。采用PCR-RFLP 方法检测受试者ER-α、β 的基因型和等位基因。将PCR 扩增产物进行酶切，凝胶成像仪上确定基因分型。

1.3 PCR 质量控制措施 为保证基因分型结果无偏移，所有标本均在盲法下进行测定。随机抽取10%样本在单盲情况下重复测定各位点基因型，以检验所测基因型的重复性和可靠性。基因引物序列及PCR 反应条件见表1。

1.4 统计学分析 所有实验数据输入SPSS 20.0统计软件包处理。计数资料采用例数(百分率)形式表达。牙周炎组和对照组基因型分布和等位基因频率进行χ2检验，单因素Logistic 回归模型分析ER基因型的危险因素。以P≤0.05 为有统计学意义。

表1 ER 基因引物序列及PCR 反应条件Table 1 ER genomic primer sequences and PCR reaction condition

2 结 果

2.1 ER-α XbaⅠ和PvuⅡ基因型分布 牙周炎组与对照组在XbaⅠ基因型表达差异无统计学意义(P=0.180 9)，其等位基因频率差异有统计学意义(P=0.036 6)。牙周炎组与对照组在Pvu Ⅱ基因型表达上差异有统计学意义(P=0.021 5)，其等位基因频率差异有统计学意义(P=0.014 6)。见图1、图2，表2。

图1 ER 基因PCR 产物经限制性内切酶XbaⅠ酶切后电泳图Figure 1 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme XbaⅠdigestion

图2 ER 基因PCR 产物经限制性内切酶PvuⅡ酶切后电泳图Figure 2 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme PvuⅡdigestion

表2 牙周炎组和对照组中的ER 基因型分布［n(%)］Table 2 Distribution of ER genotype in the patients and healthy controls n(%)

2.2 ER-β RsaⅠ和AluⅠ基因型分布 牙周炎组与对照组在RsaⅠ基因型和等位基因频率差异均无统计学意义(P=0.180 9、P=0.094 9)，牙周炎组与对照组在AluⅠ基因型表达上无统计学意义(P=0.059 4)，其等位基因频率有统计学意义(P=0.048 3)。见图3、图4，表2、表3。

2.3 男性研究对象ER-α XbaⅠ与PvuⅡ以及ER-β RsaⅠ与AluⅠ基因型分布 牙周炎组男性与对照组男性在XbaⅠ基因型表达和等位基因频率差异无统计学意义(P=0.174 6、P=0.065 5)，在PvuⅡ基因型表达和等位基因频率差异亦无统计学意义(P=0.173 4、P=0.208 0)。牙周炎组与对照组在RsaⅠ基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P=0.409 5、P=0.444 3)，在AluⅠ基因型表达和等位基因频率差异亦无统计学意义(P=0.112 9、P=0.065 2)。见表4、表5。

图3 ER 基因PCR 产物经限制性内切酶RsaⅠ酶切后电泳图Figure 3 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme RsaⅠdigestion

图4 ER 基因PCR 产物经限制性内切酶AluⅠ酶切后电泳图Figure 4 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme AluⅠdigestion

表3 牙周炎组和对照组的等位基因分布［n(%)］Table 3 Distribution of ER allele in the patients and healthy controls n(%)

2.4 女性研究对象ER-α XbaⅠ与PvuⅡ以及ER-β RsaⅠ与AluⅠ基因型分布 牙周炎组女性与对照组在XbaⅠ基因型表达和等位基因频率差异无统计学意义(P=0.178 2、P=0.213 5)，在PvuⅡ基因型表达上差异无统计学意义(P=0.074 7)，在其等位基因频率差异有统计学意义(P=0.022 9)。2 组女性RsaⅠ基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P=0.121 5、P=0.154 4)，在AluⅠ基因型表达和等位基因频率差异亦无统计学意义(P=0.453 2、P=0.337 8)。见表6、表7。

2.5 ER 基因型的单因素Logistic 分析 单因素Logistic 分析显示，携带Aa 基因型的人群的患病的风险是AA 基因型人群的0.032 倍(95%CI:0.28 ～0.93，P=0.032)，说明Aa 基因型是患牙周炎的保护因素。见表8。

表4 男性研究对象的ER 基因型分布［n(%)］Table 4 Distribution of ER genotype in the male patients and healthy controls n(%)

表5 男性研究对象的等位基因分布［n(%)］Table 5 Distribution of ER allele in the male patients and healthy controls n(%)

表6 女性研究对象的ER 基因分布［n(%)］Table 6 Distribution of ER genotype in the female patients and healthy controls n(%)

表7 女性研究对象的等位基因分布［n(%)］Table 7 Distribution of ER allele in the female patients and healthy controls n(%)

表8 ER 基因型单因素Logistic 分析结果Table 8 One-way logistic analysis of ER genotype

3 讨 论

ER 分为ER-α 和ER-β 2 个亚型。ER-α 主要表达于睾丸、子宫、骨等器官;ER-β 主要表达于前列腺、卵巢、骨等器官。近年来大量的研究证明ER 基因多态性与骨密度之间存在关联，一些研究报道了ER-α 基因多态性与骨密度之间有一定的联系［5－7］。有研究结果显示，XX 和PP 基因型对于腰椎骨密度具有保护作用，尤其是对绝经前女性及西方女性更为明显;而对于股骨颈骨密度，XX 基因型具有保护作用，PP 基因型则可能引起负面作用［8］。研究人群之间种族、年龄和环境的差异或许可以解释上述研究结果不一致的现象。但同时也有其他文献未得出相同结果［9］。牙槽骨是全身骨骼的一部分，引起全身骨质疏松的因素极大可能会引起牙槽骨的骨质疏松。Yoshihara 等［1］对日本新泻地区70 岁以上居民的研究结果显示骨密度与牙周炎存在显著关联。Ozturk 等［2］对土耳其地区居民研究结果显示下颌骨骨密度的参数和牙周破坏表现为明显的负相关。

新疆墨玉地区维吾尔族占人口绝大多数，人口流动少，具有稳定的环境和其独特的生活习惯，慢性牙周炎的发病也有其特点。本研究中发现在ER-α中，牙周炎组与对照组在XbaⅠ基因型表达差异无统计学意义，其等位基因频率差异有统计学意义，说明ER-α基因XbaⅠ多态性可能与新疆墨玉地区维吾尔族人群牙周易感性无相关关系，而等位基因与人群慢性牙周炎发病存在相关性;牙周炎组与对照组在PvuⅡ基因型和等位基因频率差异均有统计学意义，说明ER-α基因PvuⅡ可能为导致新疆墨玉维吾尔族人群慢性牙周炎的易感因子，其等位基因与慢性牙周病的发病也存在相关性。这与马敏等［10］研究结果相似。经过单因素Logistic 分析后发现，拥有pp 基因型的人群的患牙周炎的风险是拥有PP 基因型的人群的2.25 倍。携带Aa 基因型的人群的患牙周炎风险是AA 基因型人群的0.032 倍，说明Aa 基因型是患牙周炎的保护因素。在ER-β 中，牙周炎组与对照组在RsaⅠ基因型和等位基因频率差异无统计学意义;2 组在AluⅠ基因型表达上无统计学意义，其等位基因频率差异有统计学意义，这提示AluⅠ基因型的分布可能与新疆墨玉维吾尔族慢性牙周炎无相关性，但等位基因可能与新疆墨玉维吾尔族慢性牙周炎易感性相关。女性相比于男性更易出现激素失调。一些研究表明，ER-α 基因多态性与性别相关疾病有关，且是流产的危险因素［11－13］。此外有研究发现，性别对牙周病的影响中，女性比男性更易发生［14］。据推测，ER-α 基因多态性对牙周炎的影响可能在不同性别间有不同表现，故本研究以性别对分组依据。值得注意的是女性慢性牙周炎患者和对照组表现出更明显的统计学差异，然而男性患者和对照组之间差异无统计学意义。这与Zhang等［15］在研究中发现ER-α 在女性慢性牙周炎组和对照组中的结果相似。但经过统计分析后发现，性别并非ER-α 的干扰因素，说明该地区ER 基因多态性对牙周炎的影响与性别无关。本实验对ER-β RsaⅠ多态性的研究中发现，199 例受检者结果未出现rr 基因型，尚未发现与此结果相似的研究，这可能与新疆墨玉地区维吾尔族人种有关，故还需扩大样本量及在新疆不同地区维吾尔族中进一步研究以证实。

本研究探讨了ER 基因与新疆墨玉地区维吾尔族成人中、重度牙周炎的关系，初步证实新疆墨玉地区维吾尔族成人中、重度慢性牙周炎易感性与ER-α、ER-β 基因型分布相关。由于本研究中，前期流行病学调查并未检查人群的骨质疏松指数，故在今后的研究中需不断完善，加大样本量，以进一步证实ER基因多态性与维吾尔族慢性牙周炎的相关性，以及深入研究雌激素受体基因多态性与维吾尔族慢性牙周炎的发病机制。

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