miRNA-196a2 及miRNA-499 基因多态性与膀胱癌的相关性研究

徐 郑，窦全亮，贾瑞鹏，朱佳庚

0 引 言

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，是我国死亡率列于前10 位的肿瘤之一。膀胱癌的发病与多种因素相关，其中环境因素如吸烟［1］、接触化工产品、慢性感染、一些药物(如环磷酞胺、非那西汀等)及遗传因素被认为是导致膀胱癌的重要因素［2-4］。

研究显示人类基因组广泛存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)被证实与包括膀胱癌在内的多种肿瘤的发生相关［5］。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为21 ～23 nt的非编码单链，进化上高度保守。其主要通过靶向mRNA，降解靶mRNA 或从转录后水平抑制其翻译，从而阻断靶蛋白质的形成。研究显示miRNA 参与个体发育、器管形成、细胞增殖、分化和细胞凋亡等生物学过程［6］。此外，近年来研究显示在包括肿瘤［7］、心血管系统疾病等多种疾病的发生过程中均可以观察到miRNA 的异常表达［8］。有研究显示前体区的SNP 与多种肿瘤的发生相关，其中miR-196a2 前体区rs11614913 T ＞C 多态位点与多种肿瘤的发生相关，miRNA-499 前体区的多态性位点rs3746444 亦被证实与多种肿瘤的发生相关，上述2个miRNA 前体的SNP 位点与中国人群中膀胱癌发生的相关性研究报道少见［9-11］。本研究拟采用病例对照探讨miRNA 前体区rs3746444(miRNA-499)及rs11614913(miRNA-196a2)多态性位点与膀胱癌发生的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2010 年1 月至2013 年12 月在我院就诊并经临床病理诊断为膀胱癌的患者283例为膀胱癌组，其中男性218 例，女性65 例，平均年龄(66.31±13.78)岁。同期选取接受健康体检的283 人为正常对照组，其中男性217 例，女性66 例。平均年龄(65.90±13.85)岁。正常对照组经体检结果显示为正常，且无泌尿系统疾病史。患者及对照组研究对象均为南京及周边地区人群，在地理分布上无差异，均为汉族。膀胱癌组与对照组性别、年龄、吸烟、饮酒等因素的差异无统计学意义(P ＞0.05)，2 组具有可比性。本研究通过医院伦理学委员会批准，研究对象均清楚和同意该研究，并签署知情同意书。

1.2 病理诊断 病理标本由本院泌尿外科医师于手术中取出，同时取周围淋巴结与易被侵犯的远端淋巴结行病理分析，病理分析由我院病理科医师协助完成。膀胱癌依肿瘤大小(T)、淋巴结(N)和远处部位有淋巴结转移(M)(TNM)对肿瘤患者进行临床Ⅰ～Ⅳ分期;依肿瘤细胞的分化程度进行分级(高分化、中分化及低分化)。

1.3 基因组DNA 提取及检测 受试者均抽取外周血3 mL，EDTA-K2抗凝，全血经500×g 离心5 min后，去血清后在剩下的细胞中加入300 μL 人红细胞裂解液，混匀震荡3 min 溶解红细胞，10 000×g 离心30 s，沉淀白细胞，-80 ℃冻存备用;采用GoldMag全血基因组DNA 提取试剂盒(购自西安金磁纳米生物技术有限公司)，按照试剂盒说明书的操作步骤提取基因组DNA。基因组DNA 浓度和纯度采用NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪(购自美国Thermo公司)进行分析。

1.4 基因分型 从NCBI 数据库获取2 个基因多态性位点的序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)，使用Genotyping Tools 和Massarray Assay Design 软件(Sequenom 公司)设计待测SNP位点的PCR 扩增引物和单碱基延伸引物(由上海英骏生物公司合成)，并对各样本进行2 个位点对应的Massarray SNP 检测，检测过程依MassARRAY©分子量阵列技术工作站标准程序进行，主要过程包括:PCR 扩增、SAP 实验、单碱基延伸PCR 实验、树脂纯化、芯片点样、质谱分析、实验结果分析与整理。实验由陕西佰美基因股份有限公司协助完成。

1.5 统计学分析 采用SPSS 11.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差()表示，组间比较采用两独立样本t 检验;计数资料以频数和率表示，组间比较采用χ2检验，以P≤0.05 为差异有统计学意义。多态性位点的基因型与患病风险的关系分析采用二元Logistic 回归分析，以OR 及95%CI表示相对风险度。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡检验 对照组基因型进行Hardy-Weinberg 平衡检验，结果显示2 个位点均符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，提示样本来自一个稳定的群体。

2.2 基因多态性位点与肿瘤病理特征的相关性

将膀胱癌组依肿瘤的病理特征(肿瘤分期、周围淋巴结转移、远端淋巴结转移及肿瘤的分化程度)进行分组。χ2检验结果显示在不同分化程度的肿瘤分组中2 个位点的基因型差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

表1 rs11614913 及rs3746444 与膀胱癌病理参数的频数分布［n(%)］Table 1 Frequency distribution of rs11614913，rs3746444 and clinicopathological parameters of bladder cancer n(%)

2.3 基因多态性位点基因型的分布 2 个位点的基因分型分布，经多因素Logistic 回归分析，在调整了性别、年龄、吸烟和饮酒因素后，结果显示rs11614913位点的各基因型在2 组中分布差异有统计学意义(χ2=15.077，P ＜0.001)，其中TT 基因型在病例组中的频率显著低于对照组，差异有统计学差异(P ＜0.05)。rs3746444 位点的各基因型在2 组中分布差异无统计学意义(χ2=5.107，P=0.078)，但回归分析发现GG 基因型在病例组中分布显著高于对照组，组间差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 rs11614913 及rs3746444 多态性与膀胱癌发病风险的Logistic 回归分析Table 2 Logistic regression analysis on the association of rs11614913 and rs3746444 to the risk of bladder cancer

3 讨 论

MicroRNA 基因多态性与肿瘤的相关性已被广泛关注，其中rs11614913(miRNA-196a2)及rs3746444(miRNA-499)2 个位点是近年来研究的热点。在中国人群中，Yuan 等［12］对rs11614913 位点与肺癌的相关性进行了探讨，结果发现rs11614913 C 等位基因与肺癌的危险性增加有关。此外，Hu 等［13］的研究亦发现rs11614913 C 等位基因与中国妇女乳腺癌的危险性增加有关。本研究基于南京地区汉族人群，发现rs11614913 TT 基因型与膀胱癌的发生呈现负相关，与上述在中国人群中其他类型肿瘤的结果相一致。Hoffman 等［14］对该多态性位点的等位基因的功能进行了研究，结果显示rs11614913C 等位基因与miR-196a2 的低表达量相关，进而影响了其调控靶基因的能力，影响DNA 损伤后应答的效率。此外，He 等［9］荟萃分析结果显示，亚洲人群中rs11614913 TT 与肿瘤发生呈负相关(TT vs CC:OR=0.80，95%CI:0.73 ～0.88;TT vs CC+CT:OR=0.85，95%CI:0.80 ～0.92)。上述研究结果均与本研究结果一致。

MiRNA-499 rs3746444 基因多态性与肿瘤的相关性已经广泛研究。荟萃分析结果显示该位点与肿瘤的发生相关［9，11，15］;在中国人群中亦有研究发现该基因多态性与肝癌的发生相关［16］;还有研究显示该位点在亚洲人群中呈现相关性［17-18］;而在欧洲人群中未显示有相关性［19］。此外，功能研究亦显示miRNA-499 可以和c-MET mRNA 结合并降低其表达，进而促进细胞的凋亡并抑制细胞的增殖［20］。本研究结果显示rs3746444GG 基因型与膀胱癌的发生相关，与上述的研究结果相一致。

本研究还将膀胱癌组依肿瘤的病理特征进行分组，对上述基因多态性位点的基因型分布进行了χ2检验，结果显示上述2 个位点的基因型分布频率在肿瘤分期、周围淋巴结转移及远端淋巴结转移的分组中差异无统计学意义。然而，在不同分化程度的肿瘤分组中2 个位点的基因型分布频率差异有统计学意义。本研究所探讨的2 个多态性位点已被证明有生物学功能，与肿瘤的发生相关，但与肿瘤分化的相关性还未见相关报道，因此该结果还需进一步研究探讨。此外，本研究所纳入的病例数相对较少，因此进行分化程度分组后统计学效应较弱，rs11614913(miRNA-196a2)及rs3746444(miRNA-499)与肿瘤分化程度相关的结论还有待于更大样本的研究来进一步证实。

综上所述，本研究发现rs11614913(miRNA-196a2)及rs3746444(miRNA-499)基因多态性与膀胱癌的发生相关，2 个位点的基因多态性与肿瘤的分化程度相关，相关分子机制还需进一步的研究证实。

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